宫颈癌患者血清微小核糖核酸-381、微小核糖核酸-145水平变化及与临床病理参数相关性分析

吕瑜玫,陈 丹,朱 桥,王 丹

(解放军西部战区总医院妇产科,四川 成都 610083)

宫颈癌(Cervical cancer,CC)是指在致癌因子和高危因素的作用下宫颈内上皮细胞发生异常增生的女性生殖系统恶性肿瘤疾病[1]。在发展中国家最为常见,呈现正常上皮、癌前病变、早期浸润癌、浸润癌的病变过程,早期无明显症状,大多发现时病已处于晚期浸润阶段,对患者的生命健康造成极大威胁[2]。据报道[3-4],我国CC患者5年的生存率Ⅰ期为82%～90%,Ⅱ-Ⅲ期则降至50%～75%,晚期仅为20%～33%,可见其生存率随着病情恶化而不断下降。故早日诊断和治疗CC患者对于提高生存率至关重要。有研究表明[5],CC的发生发展与抑癌基因表达水平的失调有关。而随着微小核糖核酸(microribonucleic acid,miRNA)的发现为CC的诊断提供了新的标志物,miRNA为长21～23个核苷酸的非编码小分子RNA,能够负调控肿瘤相关基因表达,其异常表达与肿瘤的发生发展密切相关[6-7]。miRNA-381、miRNA-145是近来研究较多的miRNA,且在不同的病理特征中具有不同的意义,但目前多用于乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌等的临床研究,关于其与CC的文献较少[8-9]。基于此,本研究选择2018年12月至2022年12月本院收治的CC患者作为研究对象,旨在探究miR-381、miRNA-145表达水平的变化及与临床病理参数的关系,以期为临床判断病情进展和治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 将本院2018年12月至2022年12月收治的80例宫颈癌患者(观察组)和同期68例健康女性体检者(对照组)纳为研究对象。观察组年龄32～70岁,平均(58.69±7.59)岁;初潮年龄10～18岁,平均(14.26±1.52)岁;体重指数18～24 kg/m2,平均(20.56±1.79)kg/m2;怀孕次数0～1次56例,≥2次24例;遗传史有6例,无74例;乳头瘤病毒感染阳性56例,阴性24例;肿瘤直径<4 cm 32例,≥4 cm 48例;病理类型鳞癌50例,腺癌30例;病理分期Ⅰ-Ⅱ期46例,Ⅲ-Ⅳ期34例;组织分化程度低分化19例,中分化38例,高分化23例;浸润深度≤1/2肌层31例,>1/2肌层49例;脉管浸润阳性67例,阴性13例;淋巴结转移阳性29例,阴性51例。对照组年龄30～68岁,平均(57.59±7.61)岁;初潮年龄12～20岁,平均(15.12±1.46)岁;体重指数18～23 kg/m2,平均(21.42±1.66)kg/m2;怀孕次数0～1次48例,≥2次20例;遗传史是4例,否64例。两组在年龄、初潮年龄、体重指数、怀孕次数、癌症遗传史等方面比较无统计学差异(均P>0.05),具有可比性。病例纳入标准:①以病理性检测结果为诊断、分组依据;②符合《宫颈癌诊治指南解读》[10]中相关标准、临床分期等;③年龄18～75岁,意识清楚可配合评估;④入组前未接受手术、放化疗、免疫治疗等;⑤临床诊疗完整,生命体征平稳;⑥患者对本研究知情同意。排除标准:①存在其他恶性肿瘤疾病或恶性肿瘤史;②存在凝血功能异常、感染疾病、心肾功能不全、精神疾病等;③存在盆腔炎、子宫内膜异位症、子宫内膜炎等疾病。伦理委员会已批准本研究。

1.2 检测方法

1.2.1 标本采集:所有患者均于入组时未经任何处理前进行采集。于清晨空腹采集静脉血3 ml,置于促凝管后4 ℃下行1500 r/min离心处理15 min,取上层血清于-80 ℃下保存待测。

1.2.2 血清总RNA提取:应用北京天根生化科技公司生产的miRcute miRNA试剂盒提取总RNA,严格遵说明书操作。将冷冻血清样本解冻后取200 μl置于内套管中,加入1 ml裂解液震荡摇匀,室温下静置5 min待核酸蛋白复合物分离后加入200 μl氯仿混匀,静置5 min,而后4 ℃行12000 r/min离心处理15 min,取上层无色水相和2倍体积的无水乙醇混匀置于内套管静置10 min,经2次漂洗液洗脱和4次高速离心交叉后将新液移入新的RNeasy-Free离心管中,加入15 μl RNase-free ddH2O,室温下静注2 min,12000 r/min离心处理2 min得总RNA。取2 μl总RNA应用微量分光光度仪检测RNA(260/280 nm)吸光度,值为1.8～2.0。

1.2.3 RNA逆转录:应用北京天根生化科技公司生产的miRNA第一链cDNA合成试剂盒(加A法)将总RNA逆转录合成cDNA,严格遵说明书操作。解冻2×miRNA反转录缓冲液并混匀,miRNA反转录混合酶置于冰盒上备用,于预冷RNase Free反应管中加入10 μl缓冲液、2 μl混合酶、2 μl总RNA和RNase-free ddH2O至总体积20 μl。将上述配制反应物混匀后,42 ℃进行miRNA的加A尾反应和反转录反应,时间为60 min,再于95 ℃下进行酶失活反应3 min得第一链cDNA。

1.2.4 miRNA-381、miRNA-145表达水平检测:应用北京天根生化科技公司生产的SYBR Green FP250荧光定量检测试剂盒检测血清miRNA-381、miRNA-145相对表达水平,严格遵说明书操作。20 μl反应体系为:10 μl 2×miRNA定量预混试剂、2 μl cDNA、正反向引物各0.6 μl和ddH2O补足,混匀后置于PCR仪上扩增,反应程序为:预变性95 ℃、15min;变性94 ℃、20 s;退火60 ℃、34 s;40 s个循环,反应体系中荧光信号达设定阈值所循环次数为Ct值,ΔCt=Ct目标基因-Ct内参基因U6。采用2-ΔΔCt法计算miRNA-381、miRNA-145相对表达水平。应用上海生工生物有限公司合成的引物,序列如下:通用反向引物5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT-3’;其他正向引物内参U6为5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;miRNA-381为5’-CGAGUGCCACCUCTAGG-3’;miRNA-145为5’-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3’。所有操作过程均遵守《全国临床检验操作规程》[11]。

1.3 观察指标 ①比较两组的miRNA-381、miRNA-145水平。②采用t检验或F检验分析miRNA-381、miRNA-145相对表达水平与临床病理参数的相关性。

2 结 果

2.1 两组血清miRNA-381、miRNA-145表达水平比较 观察组血清miRNA-381、miRNA-145水平均低于对照组(均P<0.05)。见表1。

表1 两组血清miRNA-381、miRNA-145表达水平的比较

2.2 CC血清miRNA-381、miRNA-145表达水平与临床病理参数的关系 CC血清miRNA-381、miRNA-145表达水平与患者年龄、乳头瘤病毒感染、肿瘤直径、病理分期等因素无关(均P>0.05);与病理类型、组织分化程度、浸润深度、脉管浸润、淋巴结转移有关(均P<0.05),宫颈腺癌患者表达水平低于宫颈鳞癌,低分化、中分化、高分化患者表达水平依次升高,肌层浸润深度越深表达水平越高,脉管浸润阳性患者的表达水平低于阴性患者,淋巴结转移阳性患者的表达水平低于阴性患者(均P<0.05)。见表2。

表2 CC血清miRNA-381、miRNA-145表达水平与临床病理参数的关系

3 讨 论

据报道[12-13],CC的发生率和病死率均占全球第4位,多是由于早期病情不显,当出现阴道不规则出血、分泌物异常、下腹或腰骶部疼痛症状时已发生癌细胞浸润、转移,确诊后已无法治愈,总体生存时间仅为1年。故早日筛查、诊断和治疗是提高患者的生存率的关键。病理组织活检是诊断CC的金标准,但多为侵入性操作来获得标本,无法成为早期筛查CC的方法,而血液标本相对而言采集较为便利[14],因此为提高CC筛查诊断的准确性,探寻高敏感度、高特异性的血清标志物是十分必要的[15]。随着基因学研究的进步,miRNA在恶性肿瘤的研究中备受关注,较多学者证明了其血清异常表达水平与CC发生、发展密切相关的结论。

本研究结果显示,观察组血清中miRNA-381、miRNA-145水平均低于对照组。miRNA-381、miRNA-145均为肿瘤抑制miRNA,通过抑制成纤维细胞生长因子7(FGF7)、人类基因细胞 Myc(c-Myc)等靶基因的表达来抑制癌细胞的增生、分化、迁移、侵袭等,进而促进癌细胞凋亡,故其表达水平下降是恶性肿瘤疾病发生的危险因素[16]。崔琴等[8]研究指出,低表达miRNA-381能促进胃癌细胞的增殖与凋亡;周琨等[17]也在研究中指出,应用miRNA-381抑制剂后乳腺癌细胞的迁移、侵袭活性显著增强,说明miRNA-381是在肿瘤疾病中具有细胞保护作用的基因;黄刚、祝磊等[9,18]研究中miRNA-145在非小细胞肺癌和结肠癌中均处于低表达水平,能显著抑制癌细胞的异变过程,发挥抑制肿瘤生长和转移的作用,在肺癌、结肠癌等诊断中均具有较高的特异性和敏感性。上述研究均提示miRNA-381、miRNA-145会在恶性肿瘤疾病中呈现低表达,故其在CC中的表达也呈现低水平,恰好印证了本研究结果。徐洁欢、喻长法等[19-20]研究提示miRNA-381、miRNA-145参与CC的发生发展,在CC中呈现低表达,与本研究结果相一致。

以往有关miRNA-381、miRNA-145在CC中的报道多与其表达水平对疾病诊断的价值和对疾病进程的影响有关,较少研究其对具体临床病理参数的作用。因此本文对其在CC不同病理参数血清表达中的差异进行了研究。结果显示,CC患者血清miRNA-381、miRNA-145表达水平情况基本一致:均与患者年龄、乳头瘤病毒感染、肿瘤直径、病理分期等因素无关,与病理类型、组织分化程度、浸润深度、脉管浸润、淋巴结转移有关。结果表明,两个miRNA对CC不同病理特征的影响相当,提示二者可能在CC的发展、诊断和治疗中发挥着相似或协同的作用。miRNA-381、miRNA-145在年龄、是否存在乳头瘤病毒感染、肿瘤直径、不同分期CC的血清表达中无明显差异,提示上述miRNA的表达水平不易受患者自身情况、肿瘤自身特性等因素影响。

在与血清miRNA-381、miRNA-145表达水平相关的病理参数中,宫颈腺癌患者表达水平低于宫颈鳞癌,低分化、中分化、高分化患者表达水平依次升高,肌层浸润深度越深表达水平越高,脉管浸润阳性患者的表达水平低于阴性患者,淋巴结转移阳性患者的表达水平低于阴性患者。结果提示血清miRNA-381、miRNA-145表达水平在不同的病理特征中具有不同的意义,在病理类型、组织分化程度、浸润深度、脉管浸润、淋巴结转移等病理特征中呈现鳞癌表达高于腺癌,分化程度、浸润深度越高表达水平越高,阴性表达高于阳性的结果,正好印证了miRNA-381、miRNA-145在CC中呈现低表达的结论,同时也进一步说明其参与CC的进展能显著促进癌细胞的分化、转移和侵袭,疾病恶化程度越深其表达水平越低,可根据病理参数的变化来预测患者的病情进展,为CC患者的诊疗和预后情况提供参考依据。

综上所述,血清miRNA-381、miRNA-145在CC患者中呈低表达,其表达水平与CC的发生发展密切相关,通过检测其表达水平变化可及时筛查、诊断和治疗疾病,或可成为CC早期诊断新的生物标记物和治疗靶点。