野燕麦病原真菌的分离及鉴定

黄启超,顾琼楠,李儒海*,孙正祥

(1.长江大学农学院,湖北 荆州 434025;2.湖北省农业科学院植保土肥研究所,农业农村部华中作物有害生物综合治理重点实验室,农作物重大病虫草害防控湖北省重点实验室,湖北 武汉 430064)

野燕麦(Avenafatua)属禾本科燕麦属草本植物,原产于欧洲南部及地中海地区,随小麦进口传入中国;由于其分蘖较多、繁殖率高,是当前我国小麦田主要的恶性杂草之一,也是油菜、玉米和高粱等作物田中的重要杂草[1]。目前,对野燕麦的防除主要还是依靠化学防治,而野燕麦与小麦同属禾本科植物,形态与小麦相似,防治较为困难[2],药剂使用不当还会对小麦造成一定药害;同时,化学药剂的长期使用,还会逐渐导致野燕麦抗药性的增加,从而降低除草剂的使用效果。

利用植物病原真菌开发生物除草剂是近年来防除杂草的重要手段。目前,已有学者在野燕麦病样中分离出链格孢属(Alternaria)、弯孢属(Curvularia)、平脐蠕孢属(Bipolaris)和凸脐蠕孢属(Exserohilum)等病原真菌[3],但湖北省目前尚未有关野燕麦病原真菌的报道。本研究旨在通过对野燕麦病原真菌的分离及鉴定,明确湖北省小麦田野燕麦病原真菌种类,为其生防菌筛选及生物除草剂研发提供基础信息。

1 材料与方法

1.1 样品采集

于2023年4-5月采集湖北省小麦田自然发病野燕麦植株,记录采集地点信息,对植株发病部位进行现场拍照和保存,并用吸水纸对病样植株进行压制保存。采集地点为荆州市荆州区、沙市区、江陵县、松滋市、公安县、武汉市江夏区、汉南区、襄阳市襄州区、孝感汉川市、鄂州市华容区、咸宁市咸安区。

1.2 病原真菌分离及纯化

将采集的新鲜病样植株用dd H2O清洗干净后,在野燕麦上剪取4 mm×4 mm病健交接部位的病叶组织,用75%乙醇浸泡消毒30 s,再用0.1%的氯化汞浸泡消毒2 min,然后用无菌dd H2O浸泡清洗3遍后,置于无菌滤纸上晾干水分,最后将病叶组织移至PDA培养基上,置于25℃恒温培养箱中倒置培养;待长出菌丝后,用无菌针切取菌落边缘部位菌丝块,移至新的PDA培养基中,25℃恒温培养5 d后,保存在4℃冰箱中备用。

将分离菌株25℃恒温培养5 d后,加入5 mL无菌dd H2O至培养皿中,用无菌接种环刮下菌丝,并用4层无菌纱布进行过滤,以无菌dd H2O梯度稀释滤液至普通光学显微镜40倍镜检到1～2个分生孢子为止。取200 μL孢子悬浮液均匀涂抹在PDA平板上,25℃恒温倒置培养24 h后,将单菌落移至PDA斜面培养,待菌落长至斜面50%时,置于4℃冰箱中保存备用。

1.3 致病性测定

1.3.1 供试植物准备

采用离体叶片接种法,将野燕麦种子经0.01%赤霉酸浸泡24 h后,均匀播种在9 cm×9 cm的塑料方盒中,于25℃恒温培养箱中培养至5叶期,剪取大小一致叶片,用70%酒精消毒1 min,然后将叶片贴于直径9 cm的滤纸片上,置于直径9 cm的培养皿中,并加入3 mL无菌dd H2O保湿备用。

1.3.2 菌丝块接种

用直径6 mm打菌器打取在PDA培养基上培养5 d的分离菌丝块,用无菌针将菌丝面贴于野燕麦叶片上,以接种PDA培养基的叶片作为对照,每个菌株接种3个叶片,每个叶片接种3个菌丝块,封口后于25℃恒温培养箱中培养,2 d后移除菌丝块继续培养3 d,观察记录发病情况。

1.3.3 病原真菌再分离

剪取4 mm×4 mm接种后发病的叶片病健交接处组织,采用常规组织分离法再次对病原菌进行分离和培养,然后观察菌落形态、菌丝及孢子特征等,确定再侵染后分离出的菌株是否与原接种菌株一致,完成柯赫氏法则验证。

1.4 病原真菌鉴定

1.4.1 形态学观察

将接种后发病的菌株接种在PDA培养基上,于25℃恒温培养箱中培养5～7 d,记录观察菌落形态特征以及孢子形态和产孢结构,测量孢子和孢子梗大小。部分菌株在PDA培养基上不易产孢,可以接种在水琼脂培养基上,培养14 d后,通过光学显微镜观察。

1.4.2 rDNA-ITS序列分析

PDA平板提前铺一层玻璃纸,将菌株接种到PDA平板上,待菌落快长满平板时刮取菌丝体,采用CTAB法提取各菌株总DNA。以提取的DNA为模板,用ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)为引物,对菌株rDNA的ITS区域进行PCR扩增。建立总体积为25 μL的PCR反应体系,其中GreenTaqMix(南京诺唯赞)12.5 μL,模板DNA 1 μL,引物ITS1和ITS4(25 μmol/L)各1 μL,无菌dd H2O 9.5 μL,通过C 1 000 Touch Thermal Cycler PCR(美国伯乐)扩增。扩增条件:95℃预变性3 min,94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环;最后72℃延伸5 min,12℃保存。PCR产物经凝胶电泳检测片段大小后,送至武汉擎科生物技术有限公司进行序列测定,并在GenBank序列进行BLAST比对分析。

2 结果与分析

采集的12份病害样品中共分离出35个菌株,其在野燕麦上的病状主要为条状和不规则褐色叶斑。经对菌落、菌丝及孢子形态观察及rDNA-ITS序列比对,分离出的菌株主要为核腔菌属(Pyrenophora)、炭疽菌属(Colletotrichum)和附球菌属(Epicoccum)等。其中,核腔菌属占比最高,达82.86%;其次是附球菌属,占11.43%。将各菌株接种到在PDA培养基上,25℃培养7 d后,附球菌属的菌落直径为52～59 mm,边缘不规则,气生菌丝绒毛状,扁平,白色、浅黄色或红色,菌落背面中央暗红色,边缘红色至浅黄色;核腔菌属菌落直径80 mm左右,菌落圆形,边缘规则完整,气生菌丝初期白色,后期灰色,菌落背面中央黑色,边缘灰色或浅黄色至白色;炭疽菌属菌落75 mm左右,圆形,边缘规则,绒状,菌落初期白色,后期灰色,气生菌丝较多(图1)。

图1 野燕麦田间病样和部分菌株的菌落形态

3 讨论

目前国内有关野燕麦病原真菌的研究报道较少。本次分离出的核腔菌属、炭疽菌属和附球菌属在以往的燕麦相关研究中均有报道,其中附球菌(E.layuense)和核腔菌(P.avenicola)是引起燕麦叶斑病的病原菌[4],炭疽菌属中的禾谷炭疽菌(C.cereale)是燕麦叶枯病的病原菌[5],在野燕麦自然发病植株中还分离出黑附球菌(E.nigrum)[3]。微生物除草剂的研发需要菌株对目标杂草高度选择,对环境的负效应较小,同时对作物安全性高[6]。因此,未来还需要进一步明确这3个菌属的寄主范围和致病性,从而为评价该菌属是否具有开发成微生物除草剂的潜力和意义提供依据。