基于蛋白络合测定鞣酸纯度

朱俊，汪晨曦

（上海上药第一生化药业有限公司，上海 200240）

鞣酸，又称单宁酸，是从植物五倍子中提取的一种多酚类化合物。其含有的大量的酚羟基，可以与蛋白、多肽发生络合形成悬浮液或沉淀。因此在医药领域有广泛应用，如鞣酸软膏、鞣酸蛋白等鞣酸药物以及鞣酸小檗碱、鞣酸加压素等缓释药物。鞣酸含有大量的酚羟基，因此易氧化形成黑色的醌，致使纯度下降直接影响其与蛋白的结合能力，进而影响药品质量[1]。在我司生产鞣酸加压素的过程中，需要鞣酸和多肽加压素进行络合，也出现过络合结果不佳的问题。结合鞣酸本身的特性，我们进一步判断是因为储存不当、时间过长等原因，鞣酸物料发生氧化、受潮等变质问题影响纯度，最终降低产品质量。

鞣酸纯度的检验较为困难，通常情况下，可直接观察其颜色、性状，但此方法只能简单判断鞣酸的品质，难以确定量化的标准，作用有限。也可采取液相色谱法，但鞣酸摩尔吸光系数过高，同时其含有的酚羟基会与色谱柱发生紧密的结合，从而污染、堵塞、损坏色谱柱，产生极高的成本。紫外标准曲线法可通过鞣酸最大吸收波长（213 nm，276 nm）进行分析，但鞣酸分子所具有的25 个酚羟基易发生氧化，部分氧化后摩尔吸光系数变化极小，紫外法难以区分，故分析结果会偏高而不准确，即鞣酸氧化所导致的纯度降低，无法通过紫外检测确定[2]。因此，我们需要一种精确的、易操作、低成本的方法来检测鞣酸纯度。

受到鞣酸加压素制备过程形成多肽-鞣酸络合物的启发，我们设计了一种基于蛋白-鞣酸形成络合物的鞣酸纯度检测方法。该络合物在水中形成均匀分散而不沉降的溶液，可以用浊度评价其整个络合体系[3]。在680 nm 波长测定紫外吸收值，建立吸光度-鞣酸浓度的标准曲线，通过标准曲线法测定样品鞣酸的纯 度。

1 实验部分

1.1 材料和仪器

实验所用原料药品、试剂均购买于商业公司，未经说明使用前均不需要二次纯化。所有空气、湿度敏感型反应，都在氩气保护环境下，在烘干的玻璃容器中进行反应。所用的鞣酸标准品、待测样品购于ACROS，糜蛋白酶、胰蛋白酶、缩宫素由上海上药第一生化药业有限公司制备。所有购买的试剂除另外说明的未经进一步纯化，购买后直接使用。

高效液相色谱（HPLC）数据由Agilent 1200 Series 型号仪器，通过ZORBAX SB-C18 色谱柱测试得到。紫外检测数据均为紫外分光光度计测得，所用仪器型号为MAPADA UV-3100。

1.2 样品制备

配置浓度为0.1 M 的磷酸缓冲液，调节pH=7.0。配置梯度浓度范围为0～ 10 mg/mL 的标准鞣酸水溶液避光储存待用。将胰蛋白酶、糜蛋白酶、冻干缩宫素粉末溶于磷酸缓冲液，配置浓度为1 mg/mL、5 mg/ mL，分别作为低浓度和高浓度的蛋白溶液，用于在不同蛋白浓度下和鞣酸发生络合作用。

1.3 蛋白络合标准曲线绘制

取上述配制的0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mg/mL 标准鞣酸溶液100 μL，分别滴加进2 900 μL 的高浓度蛋白溶液，25 ℃摇床孵育30 min，转速150 r/min。取样以上溶液分别测量680 nm 处紫外吸收，获取高浓度蛋白条件下吸光度-鞣酸浓度变化曲线。

将上述实验组的高浓度更换为低浓度蛋白溶液，摇床孵育2 h，其他条件不变，获取低浓度蛋白条件下吸光度-鞣酸浓度变化曲线。

通过origin 对上述曲线进行线性拟合，方程如下：

式中A——待测样品吸光度；

x——待测样品鞣酸浓度；

k——参数。

1.4 待测鞣酸样品测试

将待测的鞣酸样品按照5 mg/mL 配制，按照实验方案滴加进不同浓度的蛋白溶液。形成稳定均匀的蛋白-鞣酸络合物后，测试其在680 nm 处紫外吸收。将吸光度带入对应蛋白拟合标准曲线，获得待测样品实际浓度，该浓度与配制浓度5 mg/mL 的比值即为待测样品鞣酸的纯度。

鞣酸纯度=（C/5）×100%

式中C——待测样品实际浓度；

5——待测样品配制浓度（mg/mL）。

1.5 鞣酸样品的HPCL 标准曲线法

取鞣酸标准品加纯化水配制成浓度分别为2、4、6、8、10 μg/mL 的对照品储备溶液。将待测样品1-3号配制为5 μg/mL 的供试品溶液。以纯化水作为空白溶剂。色谱柱为 Zorbax C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度 洗 脱（0～ 4 min，2%～ 5% A；4～ 5 min，5%～ 8%A；5～ 6 min，8% ～ 15% A；6～ 15 min，15% A；15～ 25 min，15%～ 23% A；25～ 30 min，23% A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：276 nm；柱温：25 ℃；进样量为10 μL。理论塔板数均不低于5 000。按积分面积-鞣酸浓度绘制标准曲线，将待测样品的积分面积带入标曲计算纯度。

2 结果与讨论

鞣酸可以和蛋白络合形成一种乳白色的悬浊液，根据具体浓度条件，可以维持稳定、不沉降约6～ 12 h。该体系在640～ 680 nm 波长下具备紫外吸光度，紫外吸光度和浊度成正比例关系，因此可以用紫外吸光度来评价该系统的络合状态。值得注意的是，这种吸光度的产生是由于络合产生的微颗粒对光具备散射效果，并非对光的吸收产生的降低[4]。

采取这种络合的方法制备鞣酸-蛋白络合物时，需要选取合适的蛋白体系以及合适的蛋白和鞣酸浓度。根据多次实验结果，我们发现了鞣酸络合蛋白的能力对蛋白的种类有很大差异。例如，常用的牛血清蛋白和鞣酸，在多种配比的浓度下均无法络合，观察不到悬浊液，也无法在680 nm 下测得紫外吸光度；而玻璃酸酶和鞣酸的络合非常强烈，在多种配比的浓度下形成的络合物能观察到明显的悬浮颗粒，紫外吸光度也会在读数期间发生变化，短时间内还会发生沉降。同时我们也注意到，氧化变质的鞣酸在紫外吸光度中没有明显的变化，但参与蛋白进行络合的过程差别明显，这使得该络合方法具备了区分鞣酸酚羟基氧化程度的能力。

我们选取了胰蛋白酶、糜蛋白酶作为实验组，此两种蛋白均可在实验条件内形成稳定的络合体系，可以类比鞣酸作为络合剂应用于药品生产的多种环境；选择了9 肽产品缩宫素，其分子量为1 007.2，可以类比鞣酸作为辅料、有效成分等在小分子的应用环境。基于以上方法，我们设计了鞣酸和蛋白的络合实验。以胰蛋白酶为例，选择1 mg/mL 和5 mg/mL两种蛋白浓度，可以对应不同的药品生产环境。实验过程中，我们首先将鞣酸标准品制备成不同浓度的溶液，再将鞣酸溶液滴加进蛋白溶液中，立刻出现白色浑浊。在摇床中进行孵育获得稳定体系，然后测量其在680 nm 下的紫外吸光度。我们发现，不同浓度的鞣酸所需要的孵育时间不同，低浓度的鞣酸-蛋白络合物在络合30 min 后，紫外吸光度读数还会继续上升，因此提升到2 h 来维持稳定状态。随后测量络合体系的紫外吸光度，这时可以观察到体系均匀浑浊，没有微颗粒和沉降现象。做吸光度-鞣酸浓度点图，用线性拟合获得对应的鞣酸-蛋白体系标准曲线。如图1～ 3 所示，我们测试了三种蛋白、两种浓度共6 组鞣酸-蛋白络合体，经过拟合后，标准曲线R2均在0.98 以上。结合鞣酸和蛋白络合的原理，我们认为该拟合标准曲线可以适用于该络合体系，并用于进一步判断鞣酸纯度。

图1 糜蛋白酶和鞣酸络合标准曲线Fig.1 Standard curve of chymotrypsin-tannic acid complexation

图2 胰蛋白酶和鞣酸络合标准曲线Fig.2 Standard curve of trypsin-tannic acid complexation

图3 缩宫素和鞣酸络合标准曲线Fig.3 Standard curve of oxytocin-tannic acid complexation

我们选取了三种待测样品鞣酸，新购买的鞣酸（1）和使用1、2 年后的鞣酸（2，3），按照标曲法制备了鞣酸-蛋白络合物，测试了在680 nm 处的紫外吸光度并代入标准曲线计算了纯度数据。如表1～ 3所示，同一种鞣酸样品在不同的蛋白环境下计算出的纯度数据相近，RSD ≤2%。说明使用蛋白络合的方法测定鞣酸纯度，不受限于应用蛋白浓度和体系，具有良好的准确性和可重复性。

表1 待测鞣酸样品1 数据汇总Tab.1 Tannic acid 1 datas summary

表2 待测鞣酸样品2 数据汇总Tab.2 Tannic acid 2 datas summary

表3 待测鞣酸样品3 数据汇总Tab.3 Tannic acid 3 datas summary

为进一步说明该方法的准确性，我们使用低浓度的鞣酸样品进行了HPLC 测试。如图4 为10 μg/mL 鞣酸标准品色谱图和积分面积-浓度标准曲线。对于鞣酸纯度的鉴定，尽管现有技术中并未记载以HPLC 作为鞣酸纯度鉴定的标准方法，但经该方法检测鞣酸纯度所获得的结果仍具备可接受的准确度[5]。

图4 鞣酸标准品色谱图和积分面积-浓度标准曲线，HPLC 方法Fig.4 Standard Tannic acid UV spectrum and integrated area-concentration standard curve with HPLC method

以相同条件检测待测样品1～ 3 号，并将所得积分面积代入标准曲线方程，经计算所得对应数据。结合表4 与表1～ 3 中的数据分析可得，络合体系方法所测得的数据与HPLC 所测数据相近，说明本方法具有良好的准确度。

表4 HPLC 方法测试待测鞣酸Tab.4 Measurement of tannic acid with HPLC method

3 总结

鞣酸和部分蛋白络合（如胰蛋白酶、糜蛋白酶、冻干缩宫素粉末）可以形成均匀浑浊不沉降的络合体系，该体系具备了一定的稳定性。基于以上原理，我们设计了紫外吸收光谱法测定体系浑浊度的方法，通过标准曲线法测定了不同应用体系下的鞣酸纯度。相比于直接采用紫外吸收法测定更能分辨是否发生了氧化。与常规的HPLC 方法测试结果相近。