海洋放线菌Nocardiopsis sp.HM-01 的抑菌活性及抑菌物质鉴定

许慧敏，成颖，崔萌菲，王依婷，李居行，肖逸飞，李贞景，郭庆彬，刘欢欢

（天津科技大学 食品科学与工程学院，天津 300457）

海洋放线菌是一个庞大的群体，不仅能应对高盐、高压、低温、低氧等极端环境，还具备一些独特的生理生化特征。为了适应海洋的极端环境，海洋放线菌往往会进化出独特的基因型以及代谢途径，还会产生结构新颖、功能多样的生物活性成分，这些独特功能赋予了海洋放线菌的多样性和复杂性，为各种酶及代谢产物的发掘提供了天然的筛选宝库[1-2]。

拟诺卡氏菌（Nocardiopsis）是海洋放线菌中一类较为重要的微生物资源，具有生产多种天然生物活性产物的能力，在农业、食品、环境等领域有较大的应用潜力。Nocardiopsis 为革兰氏阳性菌，该菌株需氧，耐盐不耐酸，过氧化氢酶阳性，且产生拟诺卡菌型菌丝体，其气生菌丝体带有长链孢子[3]，除海洋环境外，Nocardiopsis还可附生或内生于陆地植物中[4]。总结有关Nocardiopsis的文献，发现它可产生具有多种生物活性的化合物，特别是各种酶类，如几丁质酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、菊粉酶、激酶，具有潜在的农业价值和食品工业应用价值[5]。此外，它还可产生多种次级代谢产物，如聚酮化合物、环肽、大环内酯类、二酮哌嗪、α-吡喃酮、γ-吡喃酮、生物碱、萘醌、P-糖蛋白抑制剂、吩嗪和吩恶嗪衍生物，这些次级代谢产物具有广泛的药理和生物学作用，主要为抗菌、抗癌、抗肿瘤、免疫调节和抑制蛋白激酶等[6-7]，在生物医药与健康产业领域具有较大的应用潜力。

Nocardiopsis 菌株的分离鉴定及抑菌活性研究是目前该菌属研究的一个重点。由于其耐盐、耐碱和耐干燥的特性，使它们在陆地、室内、海洋生态系统和高盐度栖息地中均具有不同程度的适应性，因而从不同生态位中获得的Nocardiopsis 分离株的抑菌特性存在显著差异。Gopal 等[8]从河南汝南镇牧场健康山羊粪便中分离出Nocardiopsis 菌属，其对细菌和真菌病原体（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、尖孢镰刀菌和绿色木霉）具有较强的抑制活性。Schumacher 等[9]从夏威夷考艾岛浅水沉积物样品中获得一株N.dassonvillei，经纯化分离得到两种新型吲哚核苷kahakamides A，它们对枯草芽孢杆菌具有抑菌活性。Leutou 等[10]从海洋放线菌Nocardiopsis sp.CNQ-115中分离到一种新的十四元环的内酰胺类天然产物fluvirucin B6，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制活性。海绵来源的N.dassonvillei MAD08，其发酵提取物对多重耐药病原菌的抑菌活性为100%，从其发酵上清液的粗提物分离得到11 种抗菌化合物，同时包括脂溶性和水溶性抗菌化合物[11]。土壤来源的Nocardiopsis sp.MK_MSt033 可分泌18 种抗菌物质，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等具有显著的抑制效果[12]。

对抑菌活性物质的分离鉴定是天然产物发掘的关键环节，然而仅利用传统的分离分析方法获取新的天然产物已经无法满足发掘需求。随着高通量测序和信息技术的发展，微生物基因组测序数据呈指数增长，各类次级代谢产物基因簇数据库变得越来越丰富可用，为新的次级代谢天然产物的发现和研究提供了有力的帮助[13]。基因组挖掘通过分析基因组序列从而预测合成基因，进一步筛选具有特定功能的基因或基因簇[14]，根据编码蛋白的功能来预测合成产物的结构，最终通过分析预测结构寻找化合物，并进行结构鉴定[15]。其中，antiSMASH 是通过基因组预测次级代谢产物合成基因簇最常用的工具，基于核心保守基因序列，antiSMASH 可以预测基因簇类型[16]，还可以对辅助基因进行注释和分组，将代谢物核心结构最小化，使研究者能够快速识别基因组中的生物合成基因簇[17]。目前，基于基因组测序的代谢产物发掘技术已经成为研究新型先导药物的重要组成部分，在天然产物研究中发挥越来越大的作用。

基于上述背景，本研究将对实验室分离的一株海洋放线菌进行鉴别，通过对同源物种的基因组进行次级代谢产物合成基因簇的挖掘，并联合液相色谱-质谱联用技术[18]，对潜在的抑菌活性物质进行推断，以期为Nocardiopsis 菌属的抑制活性物质发掘及机制研究提供有效参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

海洋放线菌（Nocardiopsis sp.HM-01）：分离于天津大港盐湖卤水；大肠杆菌（Escherichia coli DH5α）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853）、假单胞菌（Pseudomonas sp.W407）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus CICC 21617）、鳗弧菌（Vibrio anguillarum ATCC 19264）、哈维式弧菌（Vibrio harveyi ATCC 33842）、阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae ATCC 700323）：保藏于天津科技大学食品科学与工程学院发酵食品与新资源开发研究室。

Nocardiopsis sp.HM-01 培养基为1）摇瓶种子培养基（g/L）:可溶性淀粉10 g，葡萄糖5 g，酵母粉7 g，蛋白胨7 g，NaCl 3 g，KNO33 g，MgSO4·7H2O 0.7 g，CaCO31 g，黄豆粉20 g，初始pH 值为7. 0；2）摇瓶发酵（RP）培养基（g/L）：葡萄糖30 g，可溶性淀粉10 g，酵母粉2.5 g，蛋白胨3 g，黄豆粉35 g，CaCO33.5 g，初始pH 值为7. 0；3）摇瓶发酵（international Streptomyces project medium No.2，ISP2）培养基：不调节pH 值。

指示菌培养基为LB（Luria-Bertani）培养基（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、假单胞菌、阴沟肠杆菌适用）和2216E 培养基[19]（副溶血弧菌、鳗弧菌、哈维式弧菌适用）。

上述培养基灭菌条件均为0.1 MPa、121 ℃、30 min。

1.2 仪器与设备

液相色谱仪（HPLC 1200）、紫外分光光计（Agilent 8453）：美国安捷伦科技有限公司；振荡培养箱（ZQWY-200N）：上海知楚仪器有限公司；酶标仪（Infinite 200PRO）：瑞士Tecan 公司；倒置荧光显微镜（EVOS）、扫描电子显微镜（FEI Apreo）：美国Thermo Fisher Scientific 公司；超高效液相色谱仪（Nexera 30A）：日本岛津公司；三重四极杆质谱仪（AB SCIEX TripleTOF 6600）：美国应用生物系统公司。

1.3 方法

1.3.1 形态学观察、菌株鉴定和培养

1.3.1.1 菌种制备

将-80 ℃保藏的孢子悬液，取10 μL 涂布于RP 固体培养基上，于28 ℃恒温培养箱培养5～7 d，获得新鲜孢子。轻刮一接种环孢子加到100 mL 液体种子培养基中，28 ℃、220 r/min 下培养2 d，获得种子液。按10%比例接种到液体发酵培养基中，于28 ℃、180 r/min 下培养9～15 d，获得发酵液进行后续测试。

1.3.1.2 形态学观察及菌株鉴定

在RP 固体平板上用划线稀释法活化Nocardiopsis sp.HM-01 菌株，观察平板表面形成的菌落形态，通过倒置荧光显微镜和扫描电子显微镜观察菌株的微观形态。倒置荧光显微镜制片及操作参考余济源[20]的方法。扫描电镜样品的制片参考范丽霞[21]的方法，将处理好的样品真空冷冻干燥，取样均匀粘涂在碳导胶带上，喷金后在扫描电镜下观察菌丝体和孢子的形态。

菌株16S rDNA 序列的提取[22]及测序[13]方法：挑取对数生长期菌落，采用酚-氯仿法进行抽提，氯仿-异戊醇洗脱，乙醇沉淀，三（羟甲基）氨基甲烷-乙二胺四乙酸 [tris（hydroxymethyl）aminomethane-ethylenediaminetetraacetic acid，Tris-EDTA] 缓冲液重悬，-20 ℃进行保存。经测序后，通过NCBI blast 程序，对菌株16S rDNA 序列进行比对，确定目标菌株的种属特性。之后根据序列同源性选取典型菌株的16S rDNA 序列，在MEGA 7.0 软件中，采用Neighbor-Joining 法构建系统发育树。

1.3.2 抑菌活性的测定

抑菌样品制备[23]：取发酵液加入等体积乙酸乙酯萃取3 次，用高速离心机（4 000 r/min，20 min）进行固液分离，收集有机相经氮吹浓缩得到浸膏，加入1 mL甲醇溶解，存放于4 ℃冰箱，以备后续试验。

抑菌活性测定方法：RP、ISP2 液体发酵培养基分别培养Nocardiopsis sp.HM-01，每24 h 取样1 次，经处理获得抑菌样品，以革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）为指示菌进行抑菌试验，抑菌样品测定放线菌Nocardiopsis sp.HM-01 对指示菌的抑菌圈直径（打孔法[24]）。以时间为横坐标，抑菌圈直径为纵坐标绘制生物活性曲线。

抑菌谱测定：采用打孔法[24]，将供试细菌接种至LB 培养基（10 mL），在37 ℃、180 r/min 条件下培养10～12 h，测菌液OD600nm，用无菌水将菌液稀释至1×106cfu/mL，吸取100 μL 菌液均匀涂布于LB 固体培养基，晾干后在涂布有测试菌的培养皿上打孔，加入过膜抑菌样品50 μL，37 ℃培养24 h 后测定抑菌圈直径，以等体积甲醇作为阴性对照组。

1.3.3 潜在次级代谢产物基因簇的鉴定

选取Nocardiopsis sp.HM-01 的近缘基因组序列（NCBI Assembly 数据库中的N.dassonvillei，N.albirubida 及N.synnemataformans 的基因组组装序列），首先利用Ubuntu-linux 本地化的Prokka 软件[25]对其进行全基因组注释，之后采用antiSMASH 软件对次级代谢生物合成基因簇进行预测，选取相似度高于70%的基因簇进行代谢产物推测及液相色谱-质谱（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）检测。

1.3.4 抑菌产物鉴定

将发酵液分别用乙酸乙酯萃取3 次，乙酸乙酯相经氮吹浓缩后得到浸膏，取1 mL 甲醇定量溶解。使用超高效液相色谱系统和质谱仪对抑菌样品进行LCMS 分析。

高效液相色谱条件：采用ZIC-HILIC 色谱柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）对代谢物进行鉴定。以10 mmol/L 醋酸铵和100%乙腈为流动相A 和B，流速为0.2 mL/min，洗脱梯度：0～3 min，90%B；3～6 min，90%～60%B；6～25 min，60%～50%B；25～30 min，50%B；30～30.5 min，50%～90%B；30.5～38 min，90%B。

质谱条件：电喷雾电离源负离子模式，离子电压4 500 V；去簇电压80 V；离子源温度550 ℃；气帘气压0.24 MPa；雾化气压0.38 MPa；加热器气压0.38 MPa。每个扫描周期包括1 次飞行时间质谱（time of flightmass spectrometry，TOF-MS）全扫描和15 次二级质谱扫描。TOF-MS 的质量范围设定为m/z 63～1 000，二级质谱的质量范围为m/z 30～1 000，样品进样体积为3 μL。

1.4 数据统计

研究中涉及的抑菌试验至少重复3 次以上，并采用Origin 2021 对数据进行分析作图。

2 结果与分析

2.1 形态学观察和菌株鉴定

Nocardiopsis sp.HM-01 菌株形态学观察结果见图1。

图1 Nocardiopsis sp.HM-01 菌株形态学观察Fig.1 Morphological observation of strain Nocardiopsis sp.HM-01

如图1 所示，海洋放线菌Nocardiopsis sp.HM-01在RP 培养基上，整体呈中间凹陷、边缘凸起的绒毛放线状。颜色整体为淡黄色，边缘为乳白色。将处理好的样品在扫描电镜下观察，发现放线菌Nocardiopsis sp.HM-01 菌丝以横隔分裂方式形成孢子链，孢子呈椭圆形杆状，表面光滑，形态饱满，符合Nocardiopsis 菌属的孢子形态。在电子显微镜下，Nocardiopsis sp.HM-01菌丝体呈长丝，有横隔，大多数菌丝断裂成长短近于一致的杆状孢子，每个杆状体内至少有一个核，可复制并形成新的多核菌丝体，是典型的拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）的菌丝形态[26-28]。

提取菌株Nocardiopsis sp.HM-01 的总DNA 及进行16S rDNA 的扩增，并进行测序分析，将其在NCBI数据库中进行Blast 检索，选取亲缘性较高的典型菌株序列进行系统发育分析，结果见图2。

图2 基于16S rDNA 序列的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

由图2 可知，菌株Nocardiopsis sp.HM-01 与N.alborubida NBRC 13392、N.dassonvillei IFO 14626 和N.synnemataformans DSM 44143 聚在同一分支，亲缘性最高，且自展值大于0.95。因此，综合该放线菌在形态培养特征及16S rDNA 系统发育分类学的分析，确认该菌株为拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）。

2.2 放线菌Nocardiopsis sp.HM-01 的抑菌活性研究结果

在放线菌Nocardiopsis sp.HM-01 培养过程中，每隔24 h 取样，测定经乙酸乙酯提取的抑菌样品对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌）的抑制效果，测定结果如图3 和图4 所示。

图3 不同时间Nocardiopsis sp.HM-01 发酵提取液对细菌的抑制效果Fig.3 Inhibition effect of Nocardiopsis sp.HM-01 culture media extract on bacteria at different time

图4 Nocardiopsis sp.HM-01 对革兰氏菌的抑制效果Fig.4 Inhibition effect of Nocardiopsis sp.HM-01 culture media extract on tested bacteria

由图3 可知，随着放线菌Nocardiopsis sp.HM-01培养时间的延长（5～9 d），其抑菌作用也逐渐增强，在9 d 时达到最高，之后有下降趋势，但仍维持在较高水平，表明放线菌Nocardiopsis sp.HM-01 产生抑菌活性物质是在其对数生长末期开始进入较高水平。由图4可知，由RP 培养基培养的放线菌Nocardiopsis sp.HM-01 对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）的抑菌效果显著。这与文献所报道的放线菌产生的抑菌活性物质对金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌效果相吻合[24]。

2.3 抑菌谱测试结果

采用打孔法对抑菌样品进行活性测试（孔径6.00 mm），以大肠杆菌（E.coli DH5α）、金黄色葡萄球菌（S.aureus ATCC 25923）、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa ATCC 27853）、假单胞菌（Pseudomonas sp.W407）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus CICC 21617）、鳗弧菌（V.anguillarum ATCC 19264）、哈维式弧菌（V.harveyi ATCC 33842）、阴沟肠杆菌（E.cloacae ATCC 700323）为测试菌株，以等体积甲醇作为阴性对照。不同受试菌的抑菌结果见图5。

图5 抑菌样品对不同受试菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial effect of Nocardiopsis sp.HM-01 culture media extract on different tested bacteria

由图5 可知，Nocardiopsis sp.HM-01 发酵液粗提物对S.aureus、E.coli、P.aeruginosa、Pseudomonas sp.W407、V.anguillarum 和E.cloacae 有较强的抑制活性，PR 培养基抑菌样品抑菌圈直径分别为22.4、17.3、15.0、15.5、16.7、14.2 mm，ISP2 培养基抑菌样品抑菌圈直径分别为13.9、14.9、10.5、12.8、10.7、10.9 mm。RP 培养基的抑菌效果显著高于ISP2 培养基。对V.parahaemolyticus 和V.harveyi 抑菌效果不明显。

2.4 Nocardiopsis sp.HM-01 次级代谢产物合成基因簇的预测

为进一步探究Nocardiopsis sp.HM-01 发酵液的抑菌机制，本研究对该菌株亲缘性较高的N.dassonvillei、N.synnemataformans 和N.dassonvillei sub.alborubida 的17 个基因组序列进行注释，并采用anti－SMASH 鉴定次级代谢产物基因簇，进一步发掘Nocardiopsis sp.HM-01 潜在的抑菌物质。基因簇信息统计结果见表1。

表1 Nocardiopsis sp.HM-01 潜在的次级代谢产物合成基因簇Table 1 Potential biosynthetic gene cluster related to secondary metabolites of Nocardiopsis sp.HM-01

由表1 可知，3 种放线菌共编码17 个次级代谢产物合成基因簇，包括3 个NRPS、6 个terpene、3 个siderophore、3 个ectoine、1 个lanthipeptide-class-II、1个T2PKS，其中3 种基因簇与编码desferrioxamine E、icosalide A/icosalide B、isorenieratene 的基因具有100%的相似性。具有抑菌活性的基因簇有desferrioxamine E、icosalide A、icosalide B、TLN-05220。在这些基因中还包含抗氧化基因簇isorenieratene 以及coelibactin、ectoine、2-methylisoborneol 等。

2.5 抑菌物质的液质联用（LC-MS）检测结果

为进一步确定主要抑菌的活性物质，采用超高效液相色谱-质谱联用仪对Nocardiopsis sp.HM-01 的发酵液进行检测分析，结果如图6 所示。

图6 发酵液中抑菌物质的LC-MS 图谱Fig.6 LC-MS spectrum of bacteriostatic substances in fermentation broth

由图6 可知，对应的出峰时间10.4 min、m/z=390的[M-H]-峰为乳杆菌素coelibactin；对应的出峰时间8.8 min、m/z=599 的[M-H]-峰为去铁胺E（deferoxamine E）；对应的出峰时间9.7 min、m/z=683 的[M-H]-峰为icosalide B。因此，根据质谱推测，该菌株可能会产生coelibactin、deferoxamine E 和icosalide B 这三类物质。据文献报道，coelibactin 可以作为锌载体间接调节抗生素的生产[32]。deferoxamine E 是一种铁螯合剂，能够通过与宿主体内的铁相螯合而抑制致病菌增殖。例如，金黄色葡萄球菌是人类细菌感染疾病的主要病原体，在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等多重耐药菌株存在的情况下，感染可能发展成致命的、无法治愈的疾病，尤其极易在免疫功能较低的患者中发生。而在铁限制条件下，deferoxamine E 与各种致病菌对铁资源竞争从而发挥抗菌活性，抑制细菌的生长[33]。此外，已有文献报道：68Ga-FOXE 在金黄色葡萄球菌培养物中表征出铁的快速摄取（68Ga 为一种短效发生器，能够检测到各种铁载体），这也从一定程度上表明deferoxamine E对金黄色葡萄球菌的抑制活性[34]。icosalide A/B 可通过调节细菌运动和生物膜的形成发挥抑菌作用[30]。据报道，icosalide A/B 对肠球菌和链球菌（金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌、肺炎链球菌、耐青霉素肺炎链球菌，化脓性链球菌、粪肠球菌）等细菌具有选择性抗菌活性[35]。

经antiSMASH 预测的抑菌物质中，还包括TLN-05220（相似度70%），它对一系列革兰氏阳性病原体具有很强的抗菌活性，包括多种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌菌株，并对多种人类肿瘤细胞系具有细胞毒活性[31]。但LC-MS 并未检测出TLN-05220，可能是由于TLN-05220 的基因簇表达沉默或低表达，后续还可尝试其它的培养条件及更灵敏的检测方法。

3 结论

近年来，海洋放线菌Nocardiopsis 的开发和在农业、食品、环境保护等方面发挥越来越重要的作用。Nocardiopsis 菌属可以产生丰富的酶类，如几丁质酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶等，赋予了该类菌株在农业和食品领域的应用潜力。同时，利用环境中的营养物质（污染物）生长繁殖，也可通过产生各种活性化合物调整和改善养殖生态环境、促进水生动物健康生长、实现水产养殖业持续发展。本研究通过对海洋放线菌Nocardiopsis sp.HM-01 的发酵提取物进行抑菌活性研究，考察其在不同培养条件下对不同种类细菌的抑制程度。结果表明，Nocardiopsis sp.HM-01 的发酵提取物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有一定的抑制作用，尤其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鳗弧菌、铜绿假单胞菌、假单胞菌的抑菌效果较强，具有一定的广谱抑菌效果。通过对基因组序列进行次级代谢产物基因簇的注释，联合质谱分析，鉴定出两种具有代表性的潜在抑菌化合物，deferoxamine E 和icosalide B，为该类菌株的深度开发及利用奠定了基础。