燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒稳定Pickering乳液机理及其性质

郑凯文，胡海玥，周彩莹，韩雅倩，李欣忆，刘紫韫，邢皓然，杨晨，2*，汪建明*

（1.天津科技大学 食品科学与工程学院，天津 300457；2.优滋福（天津）食品科技有限公司，天津 300457）

Pickring 乳液是由固体颗粒稳定的乳液，因其不含表面活性剂、抗聚结稳定性高、不易发生奥式熟化等优点[1]，近年来引起了人们的广泛关注。固体颗粒通过不可逆地吸附并锚定在油水界面上，形成空间位阻，稳定Pickring 乳液[2]。目前关于稳定Pickring 乳液的固体颗粒的研究主要集中在无机颗粒，如二氧化硅[3]等。虽然无机颗粒制备的Pickring 乳液具有良好的稳定性，但由于环境污染和食品安全等问题并不适用于食品工业中。因此，开发绿色环保和可生物降解的食品级固体颗粒用于稳定Pickring 乳液成为亟待解决的关键科学问题。一些食品级颗粒已被证明对稳定水包油乳液有良好的效果，例如多糖颗粒、蛋白基颗粒、类黄酮颗粒、食品级蜡和脂肪晶体等[4]。植物蛋白来源广泛、价格低、环境污染小，并且食用优质的植物蛋白可降低多种代谢性疾病的风险[5-6]，同时植物蛋白具有天然的两亲性和在液-液界面的自组装能力[7]，可以用于制备稳定Pickring 乳液固体颗粒[8]。

谷物蛋白是制备植物蛋白基Pickring 乳液乳化颗粒的来源之一。其中，燕麦中的蛋白质含量较高，通常在12%～20%[9]。从燕麦中提取的燕麦蛋白是植物蛋白的优质来源，其赖氨酸和苏氨酸含量相对较高，有相对优越的氨基酸结构[10]。燕麦蛋白主要是由12S 球蛋白组成，该球蛋白具有的六聚体结构在加热变性后展开，能够为燕麦蛋白提供与其他物质结合的交联位点[11]，同时燕麦蛋白本身又具有一定的凝胶性、乳化性、持水性、脂肪结合能力和起泡性[10]，越来越受到人们的关注。但燕麦蛋白的乳化性能有限，因此其并没有被广泛应用。袁哲[12]通过将加热变性后的燕麦蛋白与果胶结合制备的复合物用于稳定乳液，发现果胶的加入显著提高燕麦蛋白在其等电点处的乳化活性。因此，燕麦蛋白具有作为食品级植物蛋白基稳定Pickring 乳液固体颗粒的潜力，但目前相关的研究还较少。

用其他生物聚合物分子对蛋白质进行物理修饰，是提高蛋白质乳化性能的有效方法，该方法已广泛应用于制备蛋白基颗粒来稳定Pickering 乳液[13]。虫胶是一种来源于昆虫的天然聚合物，主要由羟基脂肪酸和倍半萜酸的聚酯构成，具有pH 响应性、生物降解性和生物相容性[14]。其存在的大量羧基、羟基等官能团以及大量的负电荷，可以基于非共价相互作用与多种聚合物结合[15]。Patel 等[16-17]研究发现，虫胶可以通过改变其浓度来制备具有不同纹理和热性能的油凝胶，该油凝胶可用于制备无乳化剂乳液，所制备的乳液具有温度依赖性熔化行为和良好的储存稳定性；同时利用黄原胶与虫胶的强相互作用形成的纳米物制备了pH 响应可切换的水包油乳液，该纳米物对乳液有很强的稳定作用。Yang 等[18]发现少量虫胶即可通过疏水相互作用和氢键与燕麦蛋白结合，在添加Ca2+后可进一步交联形成纳米颗粒。通过前期预试验发现，燕麦蛋白与虫胶形成的纳米颗粒可用于稳定Pickering 乳液，但是其性质及稳定机理有待进一步研究。

因此本研究利用虫胶对燕麦蛋白进行物理修饰，添加CaCl2使二者发生物理交联，制备燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒，并用燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒作为乳化颗粒制备Pickering 乳液。通过测量不同质量比下形成的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的粒径和界面湿润性以及该纳米颗粒稳定Pickering 乳液的物理稳定性和流变性能，探究不同质量比燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒稳定Pickering 乳液的机理及乳液性质，为扩大燕麦蛋白在制备植物蛋白基乳化剂方面的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

燕麦蛋白从燕麦粒中提取获得[11]，蛋白质含量为（85.07±2.40）%；虫胶：加拿大奥克维尔公司；大豆油：益海嘉里食品营销有限公司；氢氧化钠、无水氯化钙（均为分析纯）：天津市津科精细化工研究所；盐酸（分析纯）：天津市北方天医化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

FJ200-SH 高速剪切分散均质机：德国维根技术（北京）有限公司；（Zetasier Advance）纳米粒度及Zeta 电位分析仪：英国马尔文帕纳科公司；JEM-2100F 透射电子显微镜：日本JEOL 公司；PGX 动态接触角测定仪：瑞典FIBRO SYSTEM.AB 公司；LAB expert 分散体系稳定性分析仪：法国Turbiscan 公司；MARS 60 动态流变仪：德国哈克公司。

1.3 方法

1.3.1 燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的制备

将燕麦蛋白（2.0%）分散在蒸馏水中并在20～25 ℃下搅拌12 h，然后使用1 mol/L NaOH 溶液将悬浮液的pH 值调节至8.0，将上述悬浮液密封在玻璃瓶中放在115 ℃下（高于变性温度）加热15 min[11]后制得燕麦蛋白溶液。虫胶（2.0%）溶解在50 ℃水浴加热的蒸馏水中，用1 mol/L NaOH 溶液调至pH8.0，搅拌至完全溶解后得到虫胶溶液。将燕麦蛋白溶液与虫胶溶液以1∶1、2∶1、4∶1 质量比混合均匀，将混合溶液的pH 值调至7.0，然后添加0.02 mmol/L CaCl2，磁力搅拌1 h 后制得燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒溶液。在相同条件下，不添加虫胶制备的燕麦蛋白纳米颗粒作为空白对照。

1.3.2 粒径和电位测定

将燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒溶液稀释10 倍至2 mg/mL，使用纳米粒度及Zeta 电位分析仪分别测定不同质量比下燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的粒径和电位。

1.3.3 微观形貌观察

将制备的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒溶液稀释10倍至2 mg/mL，滴到铜网上，20～25 ℃干燥后使用透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）在80 kV 加速电压下观察颗粒的微观形貌。

1.3.4 接触角测定

将燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒溶液冷冻干燥24 h，制成厚度为1 mm、直径为10 mm 的薄片。将薄片置于PGX 动态接触角测定仪下，然后将15 μL 去离子水垂直滴于表面，同时拍照。采用基于Young-Laplace 方程的LB-ADSA 模型计算接触角[19]。

1.3.5 燕麦蛋白-虫胶Pickering 乳液的制备

不同质量比的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒作为稳定剂、大豆油作为油相，用高速分散均质机在12 000 r/min 下均质3min以制备乳液。乳液的总体积固定为15 mL，油相比例为60%，燕麦蛋白-虫胶纳米溶液的总浓度为2.0%。

1.3.6 乳液物理稳定性测定

采用Turbiscan 分散体系稳定性分析仪对所制备的Pickering 乳液的物理稳定性进行分析。将装有20 mL乳液的圆柱形玻璃管放入检测池中，在25 ℃下测量24 h。所有样品从上到下每隔60 min 扫描1 次，沿玻璃管的高度监测内部乳液的光学性质。通过后向散射参考模型的变化分析乳液稳定性。此外，通过Turbiscan稳定指数参数对乳剂的整体稳定性进行评价。

1.3.7 乳液流变学测定

使用MARS 60 动态流变仪测定乳液的流变特性。使用直径为35 mm、间隙为1 mm 的平行板几何形状，在0.1～100 s-1进行稳定剪切扫描，测量黏度与剪切频率的关系。1%应变下，在0.1～10 Hz 内进行动态频率扫描，记录储能模量（G′）和损耗模量（G″）与频率的关系。

1.4 数据分析

每组试验进行3 次，使用Origin 2018 软件绘制数据图，使用SPSS 26 统计分析程序采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，并使用邓肯检验来比较平均值之间的差异显著性，P<0.05 被认为是差异显著。

2 结果与分析

2.1 燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒表征

2.1.1 燕麦蛋白与虫胶不同质量比对燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒粒径和电位的影响

颗粒的粒径和多分散性指数（polydispersity index，PDI）是反映颗粒在胶体分散中稳定性的重要指标。燕麦蛋白、虫胶及不同质量比燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的粒径及PDI 如图1 所示。

图1 不同质量比对燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒粒径的影响Fig.1 Effect of different mass ratio on particle size of oat protein-shellac nanoparticles

如图1 所示，燕麦蛋白的粒径为329.0 nm，虫胶的粒径为379.5 nm。燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的粒径和PDI 随燕麦蛋白与虫胶质量比的增加先减小后增大，在燕麦蛋白与虫胶质量比为2∶1 时粒径最小为289.0 nm。燕麦蛋白与虫胶质量比为1∶1 时纳米颗粒粒径增大，这可能是由于虫胶与燕麦蛋白充分结合后，过量的虫胶引起纳米颗粒聚集所致。在燕麦蛋白与虫胶质量比为2∶1 时获得最小的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒粒径和最小的PDI 值，说明该比例可能为燕麦蛋白和虫胶的最佳结合比例，此时的虫胶能与燕麦蛋白完全结合，形成具有较好分散性和稳定性的颗粒[20]。同时对燕麦蛋白与虫胶质量比2∶1 的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的微观形貌进行观察，图1（b）中的黑点即为燕麦蛋白与虫胶质量比2∶1 的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒，可以看到该纳米颗粒为不规则的球形结构，纳米颗粒的大小低于粒径测量值，这是因为颗粒的粒径为计算结果。在燕麦蛋白与虫胶质量比为4∶1 时，少量的虫胶不能饱和燕麦蛋白的结合位点，在Ca2+的存在下，燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒会产生进一步交联，使得形成的颗粒粒径最大（787.1 nm）。Dai 等[21]通过pH 驱动法制备鼠李糖脂-玉米醇溶蛋白纳米颗粒，发现该纳米颗粒的粒径随着鼠李糖脂和玉米醇溶蛋白质量比的增加先减小后增大，这与本研究结果一致。

燕麦蛋白、虫胶及不同质量比燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的电位如图2 所示。

图2 不同质量比对燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒电位的影响Fig.2 Effect of different mass ratio on potential of oat proteinshellac nanoparticles

如图2 所示，不同质量比燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的电位小于燕麦蛋白和虫胶，说明燕麦蛋白和虫胶之间通过Ca2+发生了交联，产生了静电相互作用，从而导致纳米颗粒表面的负电荷减少。不同质量比燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的电位基本保持一致，意味着燕麦蛋白与虫胶的质量比对纳米颗粒的Zeta 电位影响有限。

2.1.2 不同质量比对燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒界面湿润性的影响

纳米颗粒的界面润湿性是制备稳定的Pickering乳液的关键。合适的润湿性可以促进颗粒吸附在油水界面上，形成空间位阻，防止液滴聚结[22]。接触角越接近90°，说明纳米颗粒的两亲性越好，越有利于提高乳液的稳定性[19]。燕麦蛋白、虫胶及不同质量比燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的接触角如图3 所示。

图3 不同质量比对燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒接触角的影响Fig.3 Effect of different mass ratio on contact angle of oat protein-shellac nanoparticles

如图3 所示，所有样品的接触角值均小于90°，说明燕麦蛋白、虫胶及燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒形成的乳液均为水包油型乳液。燕麦蛋白的接触角为60.3°。与燕麦蛋白的接触角相比，燕麦蛋白与虫胶质量比为1∶1 的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的接触角（55.5°）减小，燕麦蛋白与虫胶质量比为2∶1 和4∶1 的纳米颗粒的接触角（69.5°、71.4°）增大。说明虫胶的加入在一定程度上能够提高纯燕麦蛋白的两亲性，虫胶与燕麦蛋白的亲水区域相互结合，使燕麦蛋白内部的疏水区域暴露，进而提高燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的界面湿润性和乳化性能。而燕麦蛋白与虫胶质量比为1∶1 的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的接触角相较于燕麦蛋白减小，说明燕麦蛋白与虫胶形成纳米颗粒后，过量的虫胶会通过疏水相互作用[23]继续包裹在燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒表面，使纳米颗粒的界面湿润性降低。因此，适量的虫胶与燕麦蛋白结合能够改善燕麦蛋白的界面润湿性，但过量的虫胶会起到相反的作用。

2.2 燕麦蛋白-虫胶Pickering 乳液的性质

2.2.1 不同质量比对乳液物理稳定性的影响

采用Turbiscan 仪器对所制备的Pickering 乳液进行物理稳定性评价。后向散射光强的变化可以反映乳液体系的均匀性，在此基础上，阐明系统失稳的机理[24]。不同质量比燕麦蛋白-虫胶Pickering 乳液的后向散射光强的变化如图4 所示。

图4 不同质量比燕麦蛋白-虫胶Pickering 乳液后向散射光强的变化Fig.4 Changes of backscattered light intensity of oat proteinshellac Pickering emulsion with different mass ratio

从图4 后向散射光谱的变化可以观察到，燕麦蛋白和虫胶稳定的乳液明显不稳定，后向散射光在分析管的底部逐渐减少，并在5 mm 左右出现最低值，这是由于较小的接触角值使燕麦蛋白和虫胶更容易从油水界面脱附导致乳液不稳定，从而使乳液出现严重分层。与燕麦蛋白和虫胶稳定的乳液相比，燕麦蛋白与虫胶质量比为1∶1 的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒稳定的乳液的后向散射光整体降低，说明该颗粒稳定的乳液内部发生了聚集/絮凝[25]。燕麦蛋白与虫胶质量比为2∶1的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒稳定的乳液后向散射光变化最小，抗乳化稳定性更好。燕麦蛋白与虫胶质量比为4∶1 的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒稳定的乳液后向散射光在分析管的底部依旧逐渐减少，但最低值出现在2.5 mm 处，说明该颗粒稳定的乳液的稳定性略有提高。

浊度稳定指数（turbidity stability index，TSI）是在乳液后散射光强度变化的基础上对乳液稳定性的进一步评价，TSI 与乳液稳定性呈负相关关系[26-27]。图5 为燕麦蛋白与虫胶的质量比对燕麦蛋白-虫胶Pickering乳液TSI 的影响。

图5 不同质量比对燕麦蛋白-虫胶Pickering 乳液的浊度稳定指数的影响Fig.5 Effect of mass ratio on turbidity stability index of oat protein-shellac Pickering emulsion

从图5 可以看出，随着储存时间的延长，所有乳液的TSI 值均发生不同程度的增加，说明所有乳液随储存时间的延长均出现不同程度的不稳定现象。燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒稳定的乳液整体的TSI 值为0.48～1.22，明显低于纯燕麦蛋白和虫胶稳定乳液的TSI 值（2.57 和3.06），说明燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒稳定乳液的稳定性高于燕麦蛋白稳定的乳液，且随着质量比的增加，纳米颗粒稳定的乳液稳定性先增大后减小。纳米颗粒的界面润湿性和颗粒的大小是影响其所稳定乳液稳定性的主要因素[4]。燕麦蛋白与虫胶质量比为2∶1 的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒具有较小的粒径和良好的界面湿润性，能够不可逆地吸附在油水界面上，形成空间位阻，防止分散相聚集[4]，进而稳定的乳液表现出最好的稳定性。燕麦蛋白与虫胶质量比为4∶1 的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的界面湿润性最好，因此其稳定的乳液稳定性优于燕麦蛋白稳定的乳液。但燕麦蛋白与虫胶质量比4∶1 纳米颗粒的界面湿润性与燕麦蛋白与虫胶质量比2∶1 纳米颗粒相比仅增加了2.7%，而其粒径却比燕麦蛋白与虫胶质量比2∶1 纳米颗粒增加了170%，因此其稳定的乳液相较于燕麦蛋白与虫胶质量比2∶1 纳米颗粒稳定的乳液稳定性略有下降。燕麦蛋白与虫胶质量比为1∶1 的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒的粒径大于燕麦蛋白且接触角小于燕麦蛋白，但其稳定的乳液表现出比燕麦蛋白稳定乳液更好的稳定性，这可能是因为燕麦蛋白与虫胶质量比1∶1 纳米颗粒的电位值比燕麦蛋白电位值低，从油水界面脱离到水相中的纳米颗粒与液滴表面的颗粒更易发生相互作用，导致其重排聚集，有利于在液滴间形成网络结构[28]，因此提高了乳液稳定性。

2.2.2 不同质量比对乳液流变性能的影响

乳液的流变性能是评价乳液特性的一个重要指标，对乳液流变性的测定有助于确定乳液液滴之间的相互作用和乳液的稳定机制。不同质量比对燕麦蛋白-虫胶Pickering 乳液的表观黏度的影响见图6。

图6 不同质量比对燕麦蛋白-虫胶Pickering 乳液的表观黏度的影响Fig.6 Effect of different mass ratio on apparent viscosity of oat protein-shellac Pickering emulsion

如图6 所示，燕麦蛋白、虫胶及不同质量比燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒稳定的Pickering 乳液表观黏度均随剪切速率（0.01～100 s-1）的增加而明显降低，表现出剪切变稀行为，属于典型的非牛顿流体。这可能与流体动力学和液滴之间布朗运动的相对强度有关，当剪切速率克服布朗运动带来的阻力时，液滴在流体场中的布朗运动变得更加有序[29]。此外，燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒稳定的乳液表观黏度均大于燕麦蛋白稳定的乳液，这是因为燕麦蛋白与虫胶质量比2∶1 和4∶1 的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒中界面湿润性提高，燕麦蛋白内部的疏水区域暴露，降低了燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒在水相中的迁移率[30]。而燕麦蛋白与虫胶质量比1∶1的纳米颗粒因其表面所携带电荷量低于燕麦蛋白颗粒，液滴间的排斥力小，易发生相互碰撞，产生的流动阻力大[31]，因此也导致了高黏度。不同质量比对燕麦蛋白-虫胶Pickering 乳液的储存模量G′和损耗模量G″的影响见图7。

图7 不同质量对比燕麦蛋白-虫胶Pickering 乳液的储存模量G′和损耗模量G″ 的影响Fig.7 Effect of different mass ratio on the storage modulus G′and loss modulus G″ of oat protein-shellac Pickering emulsion

从图7 可以看出，虫胶稳定乳液的G″大于G′，而燕麦蛋白和燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒稳定的乳液均为G′大于G″，这说明虫胶稳定的乳液表现出黏性行为，而燕麦蛋白和燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒稳定的乳液表现出弹性网络特征[32-33]。燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒稳定的乳液的G′和G″对频率的依赖性较弱且均大于燕麦蛋白稳定的乳液，说明虫胶的存在使燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒稳定的乳液形成的凝胶网络结构更加致密和稳定，有利于乳液的稳定。

3 结论

本研究通过添加CaCl2使带负电荷的燕麦蛋白和虫胶发生交联，制备不同质量比的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒，用于提高燕麦蛋白Pickering 乳液的稳定性，并探究其稳定机理。结果发现不同质量比燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒稳定的乳液稳定性和流变性能均优于燕麦蛋白稳定的乳液，且纳米颗粒稳定乳液的稳定性和流变性能随质量比的增加呈现先提高后降低的趋势。燕麦蛋白与虫胶质量比1∶1 的燕麦蛋白-虫胶纳米颗粒粒径大于燕麦蛋白，界面湿润性小于燕麦蛋白，但因其表面电荷量低，颗粒间易重排聚集，有利于在液滴间形成网络结构，进而使其稳定的Pickering 乳液的物理稳定性和流变性能比燕麦蛋白稳定的乳液好。燕麦蛋白与虫胶质量比2∶1 的纳米颗粒因其较小的粒径和良好的界面湿润性，能够不可逆地吸附在油水界面上，在液滴间形成相对致密稳定的网络结构，稳定的Pickering 乳液具有最好的物理稳定性和流变性能。燕麦蛋白与虫胶质量比4∶1 的纳米颗粒界面湿润性最好，因此其稳定的乳液性能优于燕麦蛋白稳定的乳液，但由于其颗粒粒径过大，导致其稳定的Pickering乳液的物理稳定性和流变性能略低于燕麦蛋白与虫胶质量比2∶1 的纳米颗粒稳定的乳液。这些研究结果为拓展燕麦蛋白在制备植物蛋白基乳化剂方面的应用提供依据。