氯化钙处理对采后百香果细胞壁物质代谢的影响

潘家丽，陈舒柔，李木火，许华根，覃子倚，李静，李霞，董新红

（桂林理工大学 化学与生物工程学院 广西电磁化学功能物质重点实验室，广西 桂林 541004）

百香果（Passiflora edulia）属于西番莲科西番莲属，常生长于热带地区[1]。百香果营养丰富，富含维生素、矿物质、黄酮类及三萜类化合物，其果汁香浓，被称为“果汁之王”，深受消费者喜爱[2]。百香果是一种典型的呼吸跃变型水果，其成熟过程涉及色泽、硬度、细胞壁降解等生理变化，果实达到呼吸跃变高峰后便会软化皱缩，果皮色泽由光亮明艳变为灰暗无光[3]。细胞壁主要由果胶、纤维素、半纤维素等多糖类物质构成，是果实维持硬度的重要条件，其中果胶物质与纤维素交叉联接，起支撑作用，决定着果实细胞的形态与结构[4]。细胞壁降解不仅会导致果实质地软化，还会发生果皮皱缩和色彩饱和度降低的现象，直接影响果实的口感与外观，甚至会导致果实腐烂，不利于加工利用。因此，如何减缓百香果果实软化、保持果实采后生理品质是亟需解决的问题。

钙是植物细胞壁的重要组成部分，积极参与细胞壁结构的形成，维持细胞膜结构和功能的完整性[5]。采后钙处理可以使钙离子（Ca2+）与细胞壁中的果胶结合，提高细胞壁的刚性与支撑力，保持果实硬度[6]。CaCl2无毒、无臭、味微苦，是果实采后钙处理常用的试剂。研究表明，CaCl2处理可以抑制贮藏过程中冬枣[7]、番木瓜[8]、南果梨[9]硬度的下降，延缓细胞壁代谢相关酶活性的升高，对保持果实营养物质和果实品质起积极作用。Manganaris 等[10]发现，CaCl2处理可以抑制采后桃果实原果胶的降解，减缓水溶性果胶含量的增加，维持果实细胞壁完整。孙文文等[11]发现，CaCl2处理可延缓采后甜柿在贮藏期间的硬度、色差的下降，抑制多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果胶甲酯酶（pectin methylesterase，PME）活性的升高，保持甜柿坚硬，提高贮藏品质。赵临强等[12]发现，采用不同浓度的钙处理均能抑制鲜切苹果的软化，提高其抗氧化活性，延缓鲜切苹果的品质劣变。目前关于采后百香果细胞壁的研究主要集中于对果实自身细胞壁多糖成分[13]和果胶提取率[14]，而外源处理百香果并从细胞壁代谢角度分析百香果衰老软化的研究鲜见。本文以百香果为试验材料，通过研究采后CaCl2处理对百香果果实衰老过程中细胞壁代谢的影响，探讨细胞壁代谢在百香果衰老过程中的作用，为进一步研究百香果采后品质的保持提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

百香果采摘于广西万禾农业开发集团有限公司百香果种植基地，挑选形状圆润、色泽均一、无机械损伤及病虫、成熟度相近的果实进行试验。

氯化钙、乙二胺四乙酸、无水碳酸钠、乙酸钠、无水乙醇、浓硫酸（均为分析纯）：西陇化工股份有限公司；氯化钠、氢氧化钾、咔唑、蒽酮（均为分析纯）、果胶（74%）、3，5-二硝基水杨酸（99%）：上海易恩化学技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Universal TA 质构仪：上海腾拔仪器有限公司；722PC 可见分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；Nr145 电脑色差仪：厦门亿恩达科技有限公司；3-30K高速冷冻离心机：德国Sigma 公司；DZF-6020 真空干燥箱：上海齐欣科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

将220 个百香果果实分为2 组，一组以清水处理5 min作为对照（control check，CK），另一组以5% CaCl2溶液浸泡5 min。果实处理后晾干装入40 cm×30 cm、厚0.11 mm 的塑料袋中（10 个果实/袋、11 袋/处理组），在室温（22±1）℃下贮藏，每隔2 d 从各组中选取10 个百香果果实测定硬度和色泽，然后将整果果皮用液氮粉碎，置于-80 ℃贮藏，用于后续细胞壁物质含量和细胞壁代谢相关酶活性等指标的测定。所有试验均设计3 个重复，结果取平均值。

1.3.2 硬度的测定

用质构仪测定果实赤道部分的硬度，选用P50 柱形探头，测试类型为下压，目标模式为形变，目标值为10%，停留时间为2 s，测试前速度为1 mm/s，测试速度为1 mm/s，测试后速度为1 mm/s，感应力为6 g。

1.3.3 色泽的测定

色泽参考Chu 等[15]的方法进行测定。采用电脑色差仪测定果皮颜色，记录测定的L*值、b*值、c*值和h*值。依次在果实的正面、侧面、反面测定3 个点。

1.3.4 细胞壁组分的测定

细胞壁物质提取参考Qi 等[16]的方法，取5 g 果皮粉末加入25 mL 乙醇煮沸20 min，冷却后10 000 r/min离心10 min，弃上清液，重复此步骤2 遍。用体积比为1∶1 的氯仿和甲醇溶液浸泡5 min 后用丙酮冲洗，将得到的白色粉末状固体置于真空干燥箱中干燥3 d，以去离子水、50 mmol/L 乙二胺四乙酸和50 mmol/L 碳酸钠依次提取水溶性果胶、离子型果胶、共价结合型果胶，以4%和24%氢氧化钾提取半纤维素，分别得到松散型半纤维素（4KSF）、紧密型半纤维素（24KSF）。参考何俊瑜等[17]的咔唑法测定果胶含量，吸取1 mL 提取液加入试管，加入6 mL 浓硫酸，沸水浴20 min，冷却后加入0.2 mL 1.5 g/L 咔唑乙醇溶液，测定反应液在530 nm 处的吸光度。用蒽酮法[18]测定半纤维素含量，取0.5 mL上清液和1.5 mL 蒸馏水加入25 mL 试管中，然后加入0.5 mL 蒽酮乙酸乙酯试剂和5 mL 浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管准确保温1 min，取出后自然冷却至室温，测定630 nm 处的吸光度。

1.3.5 细胞壁代谢相关酶活性的测定

PG 活性参考何嘉琪等[19]的方法测定。称取2 g 百香果果皮粉末，加入20 mL 95%乙醇，低温（4 ℃）放置10 min，于4 ℃、12 000 r/min 离心20 min，取上清液，加入15 mL 80%乙醇，同条件离心，再移去上清液后加入10 mL 提取缓冲液（含1.8 mol/L 氯化钠），离心后取上清液即为酶液。分别取0.5 mL 上清液和0.5 mL 煮沸5 min 的上清液置于25 mL 具塞刻度试管中，分别依次加入1 mL 乙酸盐缓冲液（50 mmol/L、pH5.5）和0.5 mL多聚半乳糖醛酸溶液，于37 ℃水浴1 h 后，加入1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液，再沸水浴加热5 min，迅速冷却至室温，加蒸馏水稀释至25 mL，测定540 nm 处的吸光度。以每小时每克果蔬组织样品在37 ℃催化多聚半乳糖醛酸水解成半乳糖醛酸的质量表示PG 活性[μg/（h·g）]。

PME 活性测定参考郭欣等[20]的方法，略有改动。酶液提取方法同上，取0.5 mL 酶液，加入0.5 mL 10 g/L果胶溶液和1 mL 乙酸盐缓冲液（50 mmol/L、pH5.5）混合均匀，余下步骤同PG 活性的测定方法。以每小时每克果蔬组织样品在37 ℃催化果胶水解成半乳糖醛酸的质量表示PME 活性[μg/（h·g）]。

1.4 数据处理

采用SPSS 25 软件对数据进行单因素方差分析（ANOVA）检验；采用Origin 8.5 软件进行绘图，P<0.05、P<0.01 分别表示差异显著、极显著。

2 结果与分析

2.1 CaCl2 处理对百香果果实硬度的影响

CaCl2处理对百香果果实硬度的影响见图1。

图1 CaCl2 处理对百香果果实硬度的影响Fig.1 Effect of CaCl2 treatment on firmness of Passiflora edulia

由图1 可知，随着贮藏时间的延长，百香果的硬度整体呈下降趋势，且在整个贮藏期间，经CaCl2处理的果实硬度始终高于CK 组，贮藏至第4、6、8 天时，CaCl2处理组硬度比CK 组硬度分别高20.09%、20.73%和13.61%，说明CaCl2处理可以明显延缓百香果果实硬度下降，减缓果实的软化，可能是经过CaCl2浸泡后提高了百香果果实的钙含量，使细胞壁更加稳固，保持了百香果的硬度。

百香果贮藏期间外观变化见图2。

图2 百香果贮藏期间外观变化Fig.2 Appearance changes of Passiflora edulia during storage

由图2 可知，随着贮藏时间的延长，对照组百香果的皱缩程度明显高于CaCl2处理组。贮藏4 d 时，对照组的果皮已发生明显皱缩，而CaCl2处理组果皮仍光滑平整；8 d 时，对照组百香果果皮表面凹凸不平，裂痕明显，果皮褐变严重，黯淡无光，CaCl2处理组出现轻微皱缩，果皮颜色保持紫红色，表明CaCl2处理能抑制采后百香果的外观恶化，维持果实良好的商业品质。

2.2 CaCl2 处理对百香果果皮色泽的影响

CaCl2处理对百香果果皮色泽的影响如图3 所示。

图3 CaCl2 处理对百香果果皮色泽的影响Fig.3 Effect of CaCl2 treatment on color of Passiflora edulia peel

L*值代表亮度，如图3A 所示，在贮藏期间，果皮的L*值整体呈先下降后上升的趋势，贮藏至第8 天时，CaCl2处理组的L* 值较CK 组极显著升高了10.67%（P<0.01）。b*值表示色彩饱和度，如图3B 所示，贮藏至第8 天时，CaCl2处理组的b*值较CK 组极显著升高了47.37%（P<0.01）。c*值表示饱和度，如图3C 所示，CK 组和CaCl2处理组的c*值均在第2 天达到最高值，然后下降，在整个贮藏期间，CaCl2处理组的c*值明显高于CK 组。h*值表示色调，如图3D 所示，贮藏至第8 天时，CaCl2处理组的h*值较CK 组极显著升高了40.26%（P<0.01）。综上，在贮藏期间，CaCl2处理能明显提高百香果的L*值、b*值、c*值、h*值，减缓百香果色度的降低，保持果皮鲜亮。

2.3 CaCl2 处理对百香果果皮细胞壁物质降解的影响

2.3.1 CaCl2处理对百香果果皮不同果胶含量的影响

CaCl2处理对百香果果皮水溶性果胶（water soluble pectin，WSP）含量、离子型果胶（ionic bound pectin，ISP）含量、共价结合型果胶（covalently bound pectin，SCSP）含量的影响见图4。

图4 CaCl2 处理对百香果果皮果胶含量的影响Fig.4 Effect of CaCl2 treatment on pectin content of Passiflora edulia peel

由图4A 可知，贮藏过程中，CaCl2处理组和CK 组果皮WSP 含量整体呈上升趋势，CK 组WSP 含量在第0～6 天迅速上升并在第6 天达到峰值，贮藏至第8 天轻微下降，而CaCl2处理组的WSP 含量在贮藏第4 天时下降，随后又稳定上升，贮藏第8 天时，CaCl2处理组WSP 含量较CK 组显著降低了14.40%（P<0.05）。

由图4B 可知，ISP 含量变化规律与WSP 相似，整体呈上升趋势，CaCl2处理组的ISP 含量始终低于CK组。贮藏前期，两组的ISP 含量无显著差异（P>0.05），贮藏4 d 时，CK 组ISP 含量迅速升高，6 d 时略有下降，之后又迅速上升，而CaCl2处理组贮藏0～4 d 时ISP 含量比较稳定，贮藏后期ISP 含量逐步上升，贮藏8 d 时ISP 含量显著低于CK 组（P<0.05），较CK 组低17.56%。

由图4C 可知，CK 组的SCSP 含量呈先下降后上升的趋势，SCSP 贮藏至第4 天时含量最低，然后缓慢上升并趋于稳定，而CaCl2处理组的SCSP 含量则呈先上升后下降再上升的趋势，贮藏2～4 d 时，CaCl2处理组SCSP 含量始终明显高于CK 组，可能是适当的CaCl2处理促使果胶与Ca2+更好的结合，抑制了果胶水解酶的活性，从而减缓了水溶性果胶的上升，抑制了非水溶性果胶的降解。

2.3.2 CaCl2处理对百香果半纤维素（4KSF、24KSF）含量的影响

CaCl2处理对百香果半纤维素4KSF 含量、24KSF含量的影响见图5。

图5 CaCl2 处理对百香果果皮4KSF 含量、24KSF 含量的影响Fig.5 Effect of CaCl2 treatment on 4KSF content and 24KSF content of Passiflora edulia peel

由图5A 可知，CK 组中半纤维素4KSF 含量整体呈先上升后下降的趋势，4KSF 含量贮藏至第2 天时迅速上升并达到最高值，然后缓慢下降。CaCl2处理组4KSF 含量呈先上升后下降再上升的趋势，贮藏第4 天时达到峰值，并且贮藏第6～8 天时，4KSF 含量极显著低于CK组（P<0.01），较CK 组分别降低了24.30%、11.89%。

由图5B 可知，24KSF 含量整体呈下降趋势，CK组的24KSF 含量贮藏至第2 天时急剧下降，贮藏2～6 d时24KSF 含量略有上升，贮藏至第8 天时又迅速下降，较0 d 时下降了30.95%，可能是采后百香果在贮藏期间乙烯含量增加，呼吸速率加强，导致细胞壁成分解聚，而CaCl2处理组的24KSF 含量在贮藏期间处于较稳定状态，且始终高于CK 组，贮藏至第8 天时，24KSF 含量较CK 组高了25.16%。

2.4 CaCl2 处理对百香果果皮细胞壁相关代谢酶的影响

CaCl2处理对百香果果皮细胞壁相关代谢酶的影响见图6。

由图6A 可知，整个贮藏期间，CaCl2处理组和CK组的百香果果皮PG 活性整体呈先上升后下降再上升的趋势，在贮藏过程中，CaCl2处理组的PG 活性始终低于CK 组，贮藏至第8 天时，PG 活性均达到最大，但CaCl2处理组的PG 活性较CK 组极显著降低25.74%（P<0.01）。

由图6B 可知，CK 组、CaCl2处理组的PME 活性总体呈先上升后下降的趋势，均在第4 天活性达到峰值，分别为1 606.51、1 355.39 μg/（h·g），CaCl2处理组PME活性显著低于CK 组（P<0.05），较CK 组降低15.63%，说明CaCl2处理能有效延缓百香果果皮PME 活性的升高，降低活性峰值，原因可能是在PME 的作用下，外源钙会结合果胶分子在百香果成熟过程中去酯化产生的负电荷，加固细胞结构，使细胞壁水解酶不易水解细胞壁，保持百香果果实的坚硬[21]。

2.5 相关性分析

百香果各指标相关性分析结果如表1 所示。

表1 各指标间的相关性分析Table 1 Correlation analysis between various physiological indicators

由表1 可知，百香果的硬度和L*值、b*值、c*值、h* 值呈极显著正相关（r=0.895，r=0.594，r=0.660，r=0.614，P<0.01），这反映了百香果硬度与色差的关系；百香果硬度与24KSF 含量呈极显著正相关（r=0.698，P<0.01），与WSP 含量、ISP 含量、PG 活性、PME 活性呈极显著负相关（r=-0.729，r=-0.794，r=-0.612，r=-0.548，P<0.01），这反映了百香果硬度与细胞壁代谢的关系，说明百香果硬度下降、果实软化是一个细胞壁物质降解和细胞壁代谢相关酶活跃的过程。L*值与b*值、c*值、h*值之间均呈极显著正相关（r=0.798，r=0.667，r=0.810，P<0.01），说明4 个关于百香果色泽指标相互间关系较大，对采后百香果外观变化起协同作用。L*值、b*值、h*值与WSP 含量、ISP 含量、4KSF 含量、PG 活性、PME 活性之间呈极显著负相关（P<0.01），与24KSF含量呈极显著正相关（P<0.01），这反映了百香果色泽与细胞壁代谢的关系，说明采后百香果细胞壁物质代谢越快，果皮外观色泽越差。

2.6 主成分分析

对百香果贮藏期间的12 个生理生化指标进行主成分分析得到12 个主成分的特征值、方差贡献率和累积方差贡献率，结果见表2。

表2 百香果贮藏期间12 个生理指标的主成分分析Table 2 Principal component analysis of 12 indexes from Passiflora edulia during storage time

由表2 可知，特征值大于1 的共有3 个成分，3 个成分累积方差贡献率为82.266%，能代表百香果果实生理指标的大部分信息，因此选用这3 个成分代表百香果的主要品质。百香果果实硬度、L* 值、b* 值、c*值、h*值、WSP 含量、ISP 含量、24KSF 含量、PG 活性、PME 活性在PC1 上载荷最高，说明第一主成分主要反映了这10 个成分指标的信息，其中硬度、L*值、b*值、c*值、h*值、24KSF 含量在正坐标处有较高载荷，WSP含量、ISP 含量、PG 活性、PME 活性在负坐标处具有较高载荷。4KSF 含量在PC2 上载荷最高，说明第二主成分反映了该成分指标的信息。SCSP 含量在PC3 上的正坐标处有较高载荷，说明第三主成分主要反映了该成分指标的信息。在成分矩阵中，载荷绝对值反映了对主成分贡献率的大小，绝对值越大，则贡献率也越大，PC1 中贡献率大小为L* 值>b* 值>h* 值>硬度>WSP 含量>24KSF 含量>PME 活性>ISP 含量>PG 活性>c*值。

以各因子得分FAC1、FAC2、FAC3 所对应的特征值为权数，与该因子得分相乘可得出主成分得分，根据主成分得分计算百香果贮藏期间品质的综合得分，结果见图7。

图7 CaCl2 处理对百香果综合品质的影响Fig.7 Effect of CaCl2 treatment on comprehensive quality of Passiflora edulia

由图7 可知，常温贮藏期间内，综合得分逐渐降低，即百香果的贮藏品质在不断下降，在整个贮藏期间，CaCl2处理组百香果综合得分均高于对照组，说明CaCl2处理能抑制百香果细胞壁物质降解，减缓果实硬度的下降速率，维持百香果的采后贮藏品质。

3 讨论与结论

果实在成熟软化过程中发生的细胞壁降解可分为果胶物质降解和半纤维素降解[22]。WSP、ISP、SCSP 等果胶物质是初生细胞壁和中层细胞壁的重要构成之一，也是植物组织中果胶多糖和其他细胞壁成分的主要材料，其结构的改变与果实硬度变化有着极为重要的关系[23]。果实在成熟软化前，细胞壁的主要形式为水不溶性果胶，此时细胞壁完整，果实坚硬，随着果实软化，水不溶性果胶不断降解，同时产生大量水溶性果胶，细胞解体，果实衰老[24]。半纤维素的降解会增大细胞壁空隙，导致细胞壁结构的松散，加快水解酶的扩散。研究证明，果实软化过程伴随着紧密型半纤维素（24KSF）向松散型半纤维素（4KSF）降解转化[25]。硬度的大小和色泽不仅能直观反映百香果的品质，而且是评定百香果果实商品性的重要指标。本研究结果表明，贮藏至第8 天时，CaCl2处理组百香果的硬度和24KSF 含量较CK 组分别高13.61%、25.16%，WSP 含量、ISP 含量较CK 组降低了14.40%、17.56%，同时抑制了4KSF 含量的上升，减缓了SCSP 含量的降解，维持较高的L*值、b*值、c*值、h*值，保持细胞壁的完整性，使贮藏期内的果皮维持较高硬度。相关性分析结果表明，百香果硬度与24KSF 含量呈极显著正相关（P<0.01），与WSP 含量、ISP 含量呈极显著负相关（P<0.01），说明百香果硬度越低，WSP 含量、ISP 含量越高，24KSF 含量越低，即百香果的软化与细胞壁组成成分有着重要联系。

果实软化过程中伴随着细胞中胶层结构的改变，这种改变会促进细胞壁物质的降解，而包括PG、PME、纤维素酶、β-半乳糖苷酶等在内的细胞壁降解酶是导致细胞壁成分降解和果实软化的主要因素，尤其是PG和PME[26]。Lin 等[27]研究发现PG 和PME 的联合作用可以破坏果胶中层结构，降低果实软化过程中细胞壁的凝聚力。本研究结果表明，CaCl2处理能降低PG 和PME活性，有效延缓由于果皮细胞壁结构降解而导致的果皮损伤，有利于维持百香果果实的贮藏品质。相关性结果表明，PG、PME 活性与WSP、ISP 含量呈极显著正相关，与硬度、24KSF 含量呈极显著负相关（P<0.01），PG 活性与4KSF 含量呈显著正相关（P<0.05），PME 活性与4KSF 含量呈极显著正相关（P<0.01），说明PG、PME 在果实软化过程起重要作用。

综上所述，CaCl2处理在抑制百香果细胞壁代谢，延长果实货架期，延缓果皮软化皱缩方面发挥着重要作用。