豫中马铃薯早疫病病原菌的分离鉴定及防治药剂筛选

鲁进恒 东莹莹 袁 谦 范志业 张中州 吴 浩 王秋岭

（1.漯河市农业科学院 河南漯河 462000；2.河南省修武县农业技术推广中心 河南修武 454350）

马铃薯是一种重要的粮菜兼用农作物， 因其营养全面，产品开发链长，有着巨大的市场需求。 随着我国农业产业结构调整和马铃薯主粮化加速，其种植区分布逐渐趋于合理[1]，产品也实现了周年化供给[2]，整个产业呈现稳步向好的局面。

早疫病是马铃薯生产上仅次于晚疫病的第2 大病害，近年来，国内的发病状况呈逐渐加重的趋势[3]。该病可影响植株叶片、茎秆及块茎的生长，显著降低马铃薯的产量和品质，严重时减产可达39%[4]。 关于早疫病的研究，在各种植区皆有大量的报道，张建平等[5]研究了关于马铃薯早疫病孢子传播方式、病害发生规律及其与气象因子的关系，谷青等[6]报道了北方一作区马铃薯早疫病病菌不同地理群体的遗传结构，吴志会等[7]筛选出了适合冀东地区防治马铃薯早疫病的药剂，何凯等[8]明确了重庆地区的马铃薯早疫病致病菌种类及其生物学特性，赵雨佳等[9]筛选了适合重庆地区防治马铃薯早疫病的药剂。

豫中地区作为国家重要的粮食和蔬菜生产基地，马铃薯的播种面积在逐年增加，早疫病几乎连年发生。 但本地区关于早疫病的研究较少，致病菌种类尚未明确，缺乏有针对性的防治方法。 为此，本研究通过组织分离法对豫中5 地的马铃薯早疫病的病原菌进行分离纯化， 采用形态学的方法进行了菌株鉴定，并用室内毒力测定法筛选出了防治药剂，为有针对性地开展马铃薯早疫病的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料：于2022 年4-6 月，采集漯河、南阳、开封、周口、驻马店豫中5 地市的马铃薯患病叶片。

供试药剂：75%百菌清可湿性粉剂，由先正达（苏州） 作物保护有限公司生产， 商品名称为好迪施；500 g/L 氟啶胺悬浮剂， 由日本石原产业株式会社生产，商品名称为福帅得；70%丙森锌可湿性粉剂，由拜耳作物科学（中国）有限公司生产，商品名称为安泰生；50%啶酰菌胺可湿性粉剂，由巴斯夫（中国）有限公司生产， 商品名称凯泽；250 g/L 嘧菌酯悬浮剂，由先正达（南通）作物保护有限公司生产，商品名称为阿米西达。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离与纯化 采用组织分离法对病叶进行病原菌分离。 用无菌水反复冲洗病叶，剪取叶片病健交界处2～3 mm2组织块，75%乙醇溶液处理3～4 s，0.1%氯化汞消毒15～20 s， 取出后用无菌水反复冲洗3～5 遍，晾干置于PDA 平板上，在26℃的培养箱中黑暗培养，48 h 后挑取菌落边缘的菌丝进行纯化， 在26℃下培养5 d 后对纯化菌落再次进行单孢纯化[10]，获得纯化菌株后保存于PDA 斜面上，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.2 致病性测定 采用菌丝块接种法进行致病性测定[11]。 取叶龄大小一致的离体健康马铃薯叶片，用无菌水冲洗1～2 遍，用75%乙醇表面消毒1 min 后，用无菌水冲洗2～3 遍，置于培养皿中备用，皿底铺无菌纱布保湿。先将已分离菌株在PDA 上活化，后用直径为5 mm 的打孔器在菌落边缘打取菌饼，并用灭菌后的接种针对叶片作刺伤处理， 将菌饼接种到伤口处。 以无菌PDA 块作为对照，置于26℃光照培养箱培养（光周期12L∶12D），每24 h 观察1 次。 待发病后再次从病斑处分离病原菌， 并与首次分离的病原菌作对比。

1.2.3 形态学鉴定 将纯化后的病原菌菌株在PDA培养基上26℃光照培养7 d，观察并描述菌落形态及颜色、 培养基质颜色和分生孢子形态， 作为鉴定的主要依据。参照张天宇[12]的真菌鉴定方法进行形态学鉴定。

1.2.4 杀菌剂室内毒力测定 采用菌丝生长速率法测定5 种杀菌剂对病原菌菌丝生长的抑制效果[13]。用无菌水将杀菌剂配制成母液， 每种杀菌剂按有效成分稀释成5 个浓度梯度， 将不同浓度的杀菌剂加入PDA 中制成含药平板， 以不加杀菌剂的PDA 为对照，每个浓度设4 次重复（表1）。 先将储存的病原菌接种到PDA 上进行活化，在26℃的培养箱中黑暗培养5 d 后， 用5 mm 打孔器在菌落边缘打取菌饼，并分别接到制备好的含药PDA 平板和对照PDA 平板上，在26℃下黑暗培养7 d，用十字交叉法测量菌落直径。

表1 5 种杀菌剂的浓度梯度

计算杀菌剂对菌丝生长的相对抑制率，抑制率=［对照菌落直径-处理菌落直径/（对照菌落直径-0.5）］×100%。 将抑菌率换算成生物统计概率值（y），杀菌剂浓度换算成以10 为底的对数（x），根据浓度对数与概率值回归法，做毒力回归方程，计算5 种杀菌剂的抑制中浓度（EC50）及95%置信区间。利用DPS软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离结果

通过对5 地采集的32 份患病叶片的组织分离，剔除杂菌，单孢纯化后共得到93 份纯化菌株。 其中培养基呈褐色的共64 株，培养基呈黄色或红褐色共29 株，二者大致比例为7∶3。 在显微镜下观察，64 株褐色菌株的菌丝形态基本一致，判定为同一种菌株，标记为A；29 株黄色菌株的菌丝和孢子形态也基本一致，判定为同一种致病菌，标记为B（图1）。

图1 病原菌菌落形态和孢子形态

2.2 致病性鉴定

将分离纯化的2 种菌株活化培养5 d 后，分别取菌落边缘的菌丝块接种在健康的刺伤马铃薯叶片上，在光周期12 L∶12D 下26℃保湿培养4 d 发现，接种叶片与田间患病叶片症状基本相同， 应为两者复合感染， 其中B 菌株接种后的叶片具有黑色较小的轮纹状病斑，而A 则以褐色干枯为主（图2）。 将接种发病的病斑分别进行再次分离， 获得的病原菌与田间分离的病原菌一致。 依据柯赫氏法则，确定分离获得的2 种菌株均为早疫病致病菌。

图2 马铃薯早疫病田间症状及回接后的发病症状

2.3 病原菌的形态学鉴定

将2 种菌株分别接种在PDA 平板上，置于26℃下黑暗培养7 d，可形成圆形或近圆形菌落。 A 菌株的菌落为圆形（图1A 菌落），菌丝初期为白色或灰白色，后转为暗褐色，气生菌丝发达。 后期培养基为黑褐色，说明菌丝可产生黑色色素。 分生孢子顶生，形态差异较大，有椭球形、倒棒状或手雷形（图1A 孢子），大小为（15～43）μm×（8～9）μm，有短喙，多数有隔膜，横膈1～7 个，纵膈0～4 个。 B 菌株的菌落呈圆形或不规则椭圆形（图1B 菌落）菌丝早期为白色，后转为褐色，气生菌丝不发达，能产生黄褐色色素，后期培养基呈黄色或砖红色。孢子为倒棒状（图1B 孢子），量少，大小为（70～150）μm×（6～18）μm，有长喙，喙与孢身等长或略长，孢子有横膈8～15 个，纵膈4～7 个。根据《中国真菌志》的记述，结合致病性鉴定，判定A 为链格孢、B 为茄链格孢。

2.4 杀菌剂室内毒力测定

由表2 可知，5 种药剂对2 种菌株均有一定的抑制作用。 其中5 种药剂对链格孢的EC50在3.262 7～13.457 4 mg/L； 啶酰菌胺的抑制效果最好，EC50为3.262 7 mg/L；嘧菌酯效果次之，EC50为3.480 2 mg/L，百菌清效果最差，EC50为13.457 4 mg/L。 5 种药剂对茄链格孢的EC50在1.155 3～9.507 0 mg/L；嘧菌酯的抑制效果最好，EC50为1.155 3 mg/L；啶酰菌胺次之，EC50为1.951 2 mg/L，居于末位的依然是百菌清，EC50为9.507 0 mg/L。

表2 5 种杀菌剂对2 种病原菌的抑制作（单位：mg/L）

3 讨论与结论

早疫病是马铃薯生产上的主要病害， 可在叶片上引起黑色轮纹状病斑， 严重时导致大量叶片过早枯萎，此病害在豫中地区几乎连年发生，严重制约马铃薯产业的健康发展。 本研究通过形态学的方法，将该地马铃薯早疫病致病菌确定为链格孢和茄链格孢，并明确了二者的比例为7∶3。

链格孢可致马铃薯早疫病的报道最早见于1984 年[14]，其 后Boiteux L S 等[15]对 其 致 病性 进 行 了更深入的阐述。 据Lourenco V 等报道茄链格孢为早疫病致病菌的优势菌株[16]，而Kapsa J[17]和张福光[18]则分别比较了A. solani和A. alternata的致病性， 结果表明二者都可单独致病。 但本试验表明，在豫中地区马铃薯田A. alternata和A. solani的比例为7∶3，从数量上说，A. alternata为本地区的优势菌株。

据已发表的报道来看， 除本试验分离出的2 种致病菌外，尚有多种病原可致马铃薯早疫病。2009 年，Ardestani S T 报道在伊朗A. interrupta可导致马铃薯早疫病[19]， Rodrigues T T 报道了在巴西A. grandis也可导致马铃薯早疫病[20]， 2013 年郑慧慧等总括报道了致马铃薯早疫病的病原菌可达8 种之多[21]。大量研究表明，在不同地域或生态条件下，马铃薯早疫病的致病菌存在着差异。 多种病原引起同一种病害，客观上为早疫病的防治带来了困难。

为了有针对性地防治豫中地区的马铃薯早疫病，本试验选取了5 种常用杀菌剂，对分离出的2 种致病菌进行了毒力测定。 结果表明，对链格孢抑制效果最好的是啶酰菌胺，嘧菌酯次之；对茄链格孢抑制效果最好的是嘧菌酯，啶酰菌胺次之。 啶酰菌胺是一种线粒体呼吸链抑制剂，通过抑制线粒体琥珀酸酯脱氢酶活性，阻碍三羧酸循环，进而阻碍ATP 合成[22]，干扰能量传递，致菌体死亡；而嘧菌酯为一种内吸性杀菌剂，兼具保护和治疗作用，其作用机制是通过阻止特定细胞色素， 导致线粒体电子传递受到抑制以干扰能量传递[23]，使细胞致死。 这2 种杀菌剂都具有广谱、高效的特点，且都对人体安全，易于消解[24-26]，建议这2 种药交替使用，以减缓病原抗药性。