基于网络药理学和分子对接探讨解毒通利方治疗肝纤维化的作用机制

陈宇彬，林洁，蔡媛媛，程亚伟，李冠慧，蔡敏

1.广州中医药大学附属海南中医院，海南 海口 570203；2.海南省中医院，海南 海口 570203

肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)是指肝脏细胞外基质的弥漫性过度沉积，是各种慢性肝病向肝硬化发展的关键阶段，对慢性肝病的预后起着决定性作用[1-2]。慢性肝病包括肝炎病毒、代谢和遗传、胆汁淤积、免疫异常、乙醇、药物与毒物、寄生虫等病因所致的病程超过半年的各种肝病[3]。HF病情持续进展可引起肝硬化、肝衰竭、肝性脑病等严重并发症，威胁患者健康和生命。

肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化是HF形成的关键环节[4]，HSC 的激活是由大量的炎性细胞因子和生长因子介导的，其中，转运生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是肝损伤、炎症、肝再生、肝纤维化和肝细胞癌的中枢调节因子[5]。在HF过程中，TGF-β能够促进肝祖细胞的形态学改变和迁移，而进一步进行信号通路分析发现，此过程涉及多种信号通路[6]。HSC激活并增殖，产生大量的细胞外基质，因此抑制HSC的激活和增殖是预防和治疗HF的重要方法，对相关靶蛋白和信号通路进行深入研究是HF新药研发工作的重点。

目前，临床上尚无特异有效的抗HF的治疗方案，HF目前最重要的是病因治疗，但疗效仍存在一定的局限性。由于HF 病理机制复杂，针对单一靶标的药物研发很难在临床上奏效，中药复方具有多成分、多靶点、不良反应少等优点，中医药近年来已成为防治HF的研究热点，广泛开展的实验研究与应用实践证实了其在HF防治领域中医的特色优势与突出疗效[7]。

海南省名中医蔡敏教授基于“初病湿热在经”提出以清热利湿为法，治疗HF初期湿热阶段，将治疗关口前移，以提前干预HF 的持续发展过程和不良结局[8]。因此，蔡敏教授根据数十载临证及用药经验创制了治疗本病的经验方：解毒通利方。本方源自《伤寒论》清热利湿退黄经典方剂茵陈蒿汤，诸药加减兼顾清热解毒、调气行血、健脾扶正。此外，方中运用了多种海南特色南药、黎药，使本方具有一定的地域特色与民族特色，如地耳草，又名田基黄，黎医用于治疗黄疸，体现了黎医“以黄治黄”的用药特点[9]。解毒通利方临证中屡获良效，本研究通过网络药理学的方法探讨解毒通利方治疗HF 可能的作用机制，并通过分子对接技术在计算机层面模拟验证，旨在为将来进一步开展解毒通利方治疗HF的药效学机制体内外实验研究提供初步科学假说与依据。

1 资料与方法

1.1 获取解毒通利方的活性化合物及有效活性成分靶点 以茵陈、大黄、栀子、鸡骨草、地耳草、凤尾草、白花蛇舌草、丹参、叶下珠、鸡内金、神曲、甘草分别作为关键词,在TCMSP 数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、HERB 数据库(http://herb.ac.cn/)中进行化合物成分检索，设置口服生物利用度(OB)过滤条件≥30%，类药性(DL)过滤条件≥0.18。通过TCMSP 数据库将上述活性化合物进行成分靶点检索。运用UniProt 数据库(http://www.uniprot.org)下载人类靶蛋白，最后，使用处理文本文件的Perl语言对筛选出的活性成分的靶点信息与之匹配和规范。

1.2 检索HF 的疾病靶点 在人类基因数据库(GeneCards，https://www.genecards.org/)、药物遗传学和药物基因组织学数据库(PharmGkb，https://www.pharmgkb.org/)、药物靶点数据库(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)、人类在线孟德尔遗传数据库(OMIM，https://omim.org/)、Drugbank 数据库(https://www.drugbank.ca)中检索关键词“Hepatic fibrosis”、“Liver fibrosis”以获得HF的疾病相关靶点。

1.3 确定解毒通利方治疗HF的作用靶点 将筛选出的解毒通利方有效活性成分靶点数据与HF疾病靶点数据使用R 语言4.1.2 程序取交集，并绘制韦恩图。从而确定解毒通利方治疗HF的作用靶点。

1.4 蛋白互作(PPI)网络构建与关键靶点 将解毒通利方有效活性成分与HF 疾病交集靶点数据，即1.3中得到的结果上传至STRING数据库(https://www.string-db.org/)进行PPI 网络构建，物种参数选定为“Homosapines”，自定义可信度＞0.95 和隐藏游离点，构建PPI 网络。将PPI 网络数据导入Cytoscape 3.8.0中，应用“CytoNCA”插件筛选核心靶点，通过打分对节点赋值，选中分值高的节点构建新的网络，重复进行以上“打分—选中—构建”这一过程以获得核心靶点。

1.5 “中药—关键化合物—核心靶点”网络构建 将1.4中获得的核心靶点名称和其对应的关键化学成分整理成表格文件，导入Cytoscape 3.8.0软件中，并构建“中药—关键化合物—核心靶点”网络。应用“Networkanalyzer”插件获得节点的度值。通常看来，节点度值高，将被视作有意义的活性化合物或作用靶点，能够在自身所处的生物网络中发挥枢纽性的作用[10]。

1.6 基因本体(gene ontology，GO)功能与京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析 基于R 语言4.1.2 程序Bioconductor、Pathview 等数据包，设定P＜0.05 为差异有统计学意义，对交集靶点数据进行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，选取GO 富集分析前10 名BP、CC、MF 结果和KEGG 通路富集分析前10 名结果进行可视化。

1.7 分子对接模拟验证 首先，从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载所选择的活性化合物即小分子配体的2D 结构，并使用Chem Office 软件转化为3D 结构，运行energyminimize 后保存。第二，通过PDB 数据库(http://www.rcsb.org)下载大分子蛋白受体的3D结构，使用Pymol软件对蛋白受体和化合物配体进行去除水分子等操作。第三，利用Auto Dock Tools 软件对受体进行加氢，确定配体与受体结合的活性口袋[11]。最后，运用Auto Dock vina 软件将两者进行对接，计算配体和受体结合的最低结合效能，据此进行排序，并在Pymol软件中对分子对接结果进行展示。

2 结果

2.1 解毒通利方活性化合物与有效活性成分靶点 通过TCMSP数据库和HERB数据库，筛选出活性化合物172种，其中茵陈10种、大黄4种、山栀子6种、鸡骨草1种、地耳草2种、叶下珠1种、白花蛇舌草1种、鸡内金1 种、神曲1 种、丹参54 种、甘草81 种。运用TCMSP 数据库预测获得的活性化合物靶点信息，经Uniprot数据库、Perl语言对应与规范靶点基因名汇总删重后，共预测靶点4 068 个，其中茵陈306 个、大黄27个、山栀子276个、鸡骨草59个、地耳草248个、叶下珠271个、白花蛇舌草190个、鸡内金4个、神曲204个、丹参799个、甘草1 494个。

2.2 HF的疾病靶点 在Gencards数据库里检索获得到HF 疾病相关基因4 855 条，PharmGkb 数据库获得31个基因，OMIM数据库获得63个基因，TTD数据库获得21个基因，Drugbank数据库获得13个基因，将以上5 个数据库检索获得的基因数据整合去重，共获得HF疾病相关基因4 877个，见图1。

图1 HF疾病靶点提取Figure 1 Extraction of HF disease targets

2.3 解毒通利方治疗HF的核心靶点 将筛选出的解毒通利方的有效活性成分靶点数据与HF疾病靶点数据使用R 语言4.1.2 程序(bioconductor 等数据包)取交集，获得解毒通利方治疗HF 的核心靶点199 个，并绘制韦恩图，见图2。

图2 HF与解毒通利方交集靶点的韦恩图Figure 2 Wayne diagram of the intersecting target of HF and Jiedu Tongli Decoction

2.4 PPI 网络构建与关键靶点 如图3 所示，PPI网络中共有156个节点，1 088条边。应用“CytoNCA”插件筛选核心蛋白，通过打分对节点赋值，选中分值高的节点构建新的网络，重复进行以上“打分—选中—构建”这一过程，筛选出19 个核心蛋白，分别为CDKN1A、IL6、MAPK14、AKT1、HSP90AA1、TNF、ESR1、MAPK3、STAT1、RELA、RB1、MYC、FOS、STAT3、MDM2、MAPK1、HIF1A、TP53、CCND1，见图4。

图3 PPI网络构建Figure 3 PPI network construction

图4 解毒通利方与HF交集靶点的PPI网络Figure 4 PPI network of intersecting targets of Jiedu Tongli Decoction and HF

2.5 “中药—关键化合物—核心靶点”网络构建“中药—关键化合物—核心靶点”网络共由156个节点和304 条边组成(图5)。网络中的边表示相互作用，“中药—关键化合物—核心靶点”网络图展示了关键化合物与核心靶点两者之间并非一一对应的关系。一个化合物可以同时作用于多个靶点发挥活性作用，反过来说，一个靶点可以同时受多个化合物调节产生不同影响[10]，这种相互的、复杂的、多元的作用模式反映了中药多成分、多靶点、多途径的作用潜能与优势。根据网络的节点度值参数排序，排名前5 的化合物分别为甘草查尔酮(licochalcone a，MOL000497)、柚皮素(naringenin，MOL004328)、异鼠李素(isorhamnetin，MOL000354)、去甲氧基茵陈色原酮(demethoxycapillarisin，MOL008046)、5-hydroxy-7-methoxy-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl)chromone(MOL003095)，从靶点来看，排名前5的分别是HSP90AA1、ESR1、MAPK14、RELA和MAPK1。

2.6 GO富集 GO富集分析共得到2 612条生物过程(BP)相关条目、234 条分子功能(MF)相关条目、89条细胞组分(CC)相关条目。基于R 4.1.2程序，根据参与的分子数量，对前10 位的BP、CC、MF 进行可视化，以条形图展示(图6)。生物过程主要涉及氧化应激、化学应激、氧水平感知等。分子功能主要涉及核受体活性、配体激活的转录因子活性和细胞因子受体结合等。细胞组分主要涉及膜阀、转录调节复合物、蛋白激酶复合物等。

图6 GO注释分析的前10名BP、CC和MF结果Figure 6 Top 10 BP,CC,and MF results in GO analysis

2.7 KEGG通路富集 通过KEGG富集结果筛选出181条通路(P＜0.05)，提示解毒通利方可能通过调控多条通路起到治疗HF 的作用。根据P值筛选KEGG结果前30名通路使用R 4.1.2程序进行可视化，绘制气泡图(图7)。通路富集以病毒感染、炎症反应、细胞凋亡、脂质代谢、肿瘤等相关的信号通路为主，具体涉及PI3K/AKT信号通路、白细胞介素17(IL17)信号通路、T辅助细胞17(Th17)细胞分化、乙型肝炎、丙型肝炎、肿瘤坏死因子信号通路、糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路、流体切应力与动脉粥祥硬化、爱泼斯坦—巴尔病毒感染、癌症中的蛋白多糖、前列腺癌、内分泌抵抗等通路。进一步利用R语言4.1.2程序基于Pathview数据包提取信息，绘制与HF疾病的通路图。从通路图中可以看出AKT、STAT3 等在HF 发病过程中起到重要作用，HF的靶点是多路径协调控制的(图8)。

图7 前30名KEGG通路富集图Figure 7 Top 30 pathways in KEGG pathway enrichment analysis

图8 靶点在HF疾病中的通路图Figure 8 Pathway map of targets in HF disease

2.8 分子对接验证 基于以上结果，AKT1 和STAT3 为PPI 网络核心中的关键蛋白，甘草查尔酮(licochalcone a，MOL000497)、柚皮素(naringenin，MOL004328)均为网络中排名前5 位的化合物，即关键有效活性成分。故选择AKT1 和柚皮素、STAT3 和甘草查尔酮分别作为大分子蛋白受体和小分子化合物配体，进行分子对接。使用Autodockvina 进行分子对接，结果显示AKT1 和柚皮素的结合自由能为-6.0 kJ/mol(图9)，STAT3 和甘草查尔酮的结合自由能为-6.8 kJ/mol (图10)，说明关键化合物与核心蛋白的结合构象能量低，结构稳定。

图9 甘草查尔酮与AKT1分子对接Figure 9 Docking of licorice chalcone with AKT1 molecule

图10 柚皮素与STAT3分子对接Figure 10 Docking of Naringenin with STAT3 molecules

3 讨论

HF属于中医学“肝积”、“积聚”、“胁痛”、“黄疸”等范畴，中医学认为本病是由感染疫毒或外感湿热，邪毒羁留不去，以致气血津液搏结，肝络瘀阻，而发为本病。由于湿邪其性黏滞，与热邪相合则出现湿热胶着难解、肝病缠绵难愈之象，日久正气为之所伤，逐渐由实而虚、由表及里，由气入血形成“湿、热、毒、瘀、虚”互结的复杂局面。治疗上，不同医家各有侧重，但大多从瘀、虚论治。由于HF 往往存在病情持续进展的不良病程和结局，蔡敏教授从中医治未病“既病防变”的理念出发，认为提前干预与及时治疗更为重要。根据叶天士《临证指南医案》“初病湿热在经，久则瘀热入络”的理论，蔡敏教授认为湿热邪气导致肝脏炎症反应，是肝纤维化的始动因素[8]。在我国，特别是外感湿热之邪而致的慢性乙型病毒性肝炎，肥人脾虚、痰湿内生、日久蕴热为核心病机的非酒精性脂肪肝，均为常见慢性肝病的主要原因。湿热日久，化瘀化热，入里入络，慢性肝炎活动的过程即HF 不断发展的过程[12]。因此，蔡敏教授创造性地提出以清热利湿为法治疗本病，并总结出经验方—解毒通利方。方中茵陈为君药，清热利湿，解毒退黄；大黄为臣药，既入气分，又入血分，可泻下攻积，清热解毒，利胆保肝，使湿热从大便而出，此外，功兼活血行瘀；山桅子有清热凉血之功，不仅可入胃荡涤热邪下行，还配伍茵陈走表利便，以助消解瘀热，与大黄共为臣药。蔡敏教授善用南药、黎药，在方中运用了鸡骨草、田基黄、凤尾草、叶下珠、白花蛇舌草等药物，增强清热利湿解毒之力，“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”，故方中酌加神曲、鸡内金以健运脾胃，先安未受邪之地，丹参化瘀凉血，甘草调和诸药，全方清热利湿、化瘀解毒、通利二便及血脉。

研究发现，解毒通利方中含有甘草查尔酮、柚皮素、异鼠李素、去甲氧基茵陈色原酮等活性成分对应的作用靶点较多，或在治疗HF 中发挥重要作用。柚皮素可通过抑制氧化应激、炎症等相关通路，如TGF-β/Smad3、JNK/Smad3 信号通路实现抗肝纤维化的效果[13]。动物研究还证实，柚皮素可通过抑制内质网应激与细胞凋亡减轻四氯化碳诱导的大鼠肝细胞损伤从而缓解HF[14]。异鼠李素可通过下调p38MAPK 信号通路、TGF-β/Smads 信号通路、TLR 信号通路减轻氧化应激、抑制细胞外基质生成等以减少胶原合成，进而改善HF[15-17]。

在PPI网络中，IL-6、AKT1、ESR1、MAPK3、STAT1、RELA、MYC、FOS、STAT3、MAPK1、CCND1等19个靶点为解毒通利方治疗肝纤维化的核心蛋白。AKTl是PI3K的下游信号蛋白，参与调节HSC的活化、增殖、分化和凋亡等过程[18]。此外，TGF-β能够促进肝祖细胞的形态学改变和迁移，PI3K/AKT 信号为高富集信号通路[6]。信号转导和转录激活因子3(STAT3)可受Janus激活激酶2(JAK2)表达和活性增加而促进其生成，进而诱导IL-6及TGF-β1表达[19]，其中，IL-6能介导肝损伤的急性期反应[15]，还可以通过MAPK、JAK2/STAT3通路直接诱导HSC转化为肌成纤维样细胞，导致细胞外基质沉积[20]，促进肝纤维化。肝细胞中的MYC基因过度表达可促进HSC的活化[21]；肝实质细胞属于静止期细胞，在肝发育和再生过程中，RELA参与了关键的生物化学过程，RELA 缺乏会导致小鼠肝细胞变性和胚胎发育停止[22]。CCND1 可调控细胞增殖、DNA 修复及细胞迁移等[23]。

GO功能和KEGG通路富集分析结果表明，解毒通利方治疗HF作用的靶点主要体现在氧化应激、细胞凋亡、炎症、病毒感染、脂质代谢等生物学过程及调节PI3K/AKT 信号通路、TNF 信号通路、肝炎病毒感染、Th17 细胞分化、HIF-1 信号通路、肿瘤信号通路等方面。许多研究表明，下调TGF-β1[24]、lincRNA-p21[25]、炎症介质等调节PI3K/AKT 信号通路，可以通过抑制HSC活化、肝实质细胞自噬[26]、减少肝实质细胞上皮细胞—间充质转化[27]等途径实现抗肝纤维化的作用。Varela-Rey 等[28]研究发现，大鼠肝星状细胞内MAPK磷酸化可受TNF-α减少影响，从而调节I型胶原蛋白表达，使其产生的胶原更易降解。HF患者体内T淋巴细胞亚群发生改变，发挥抗炎效用的T 辅助细胞(T helper cells 17，Th17)和调节性T 细胞(regulatory T cells，Treg)，前者比例升高，后者较正常水平降低[29]，而Th17/Treg 平衡受JAK2/STAT3 调控[30]。除此之外，JAK2/STAT3信号通路可能通过HSC与纤维母细胞转分化[31]、肝组织和胆总管纤维化相关蛋白表达[32]、巨噬细胞功能[33]等有关。HIF-1α是诱导细胞缺氧适应的关键转化调节因子，相关报道称MAPK也与HIF-1α活性调节有关，两者均参与了缺氧条件下HSC的激活[34]。

在分子对接过程中，配体和受体分别选择AKT1和柚皮素、STAT3和甘草查尔酮，结果显示结合能为负值，构象能量低提示模拟对接双方结构稳定、结合活性好，表明解毒通利方中关键化合物成分可能通过作用于靶蛋白AKT1、STAT3，调节PI3K/AKT、JAK2/STAT3信号通路，干预肝纤维化进程，促进机体修复，其作用机制可能与抑制HSC活化与上皮间质转化有关。

综上所述，本研究基于网络药理学和分子对接技术初步预测与验证了解毒通利方治疗HF的关键活性成分、核心作用靶点及主要的信号通路，解毒通利方治疗HF 的作用可能是通过柚皮素、异鼠李素等多种活性成分作用于IL-6、AKT1、STAT3、MAPK 等多靶点，通过PI3K/AKT、TGF-β/Smads、JAK2/STAT3 等多条信号通路来实现的，但仍需进一步体内外实验研究验证。本研究揭示了解毒通利方具有多成分、多靶点、多途径协同作用的分子机制，可为临床治疗HF及下一阶段的深入研究提供参考。