MALDI-TOF MS技术在真菌鉴定和药敏试验中的影响因素研究

李家政,缪杨阳 综述,郭 勇 审校

南京中医药大学附属苏州市中医医院检验科,江苏苏州 215000

近年来,由于恶性肿瘤的高发病率及化疗药物、广谱抗菌药物和免疫抑制剂等在临床的广泛应用,侵袭性真菌感染的发生率和病死率呈明显上升趋势[1]。真菌感染的临床表现复杂,顽固难治愈,易误诊误治,早期抗真菌治疗对患者生存至关重要。抗真菌治疗不充分、延迟开始治疗时间均会增加患者的病死率[2]。传统的真菌鉴定方式,尤其是丝状真菌的鉴定,主要依赖形态学方法。由于检验人员专业水平和经验参差不齐,其准确性和时效性较差,鉴定困难和鉴定错误的情况时有发生,进而导致治疗失败、病情延误。虽然分子测序技术是真菌鉴定的“金标准”,但其操作复杂、价格昂贵且对实验条件和人员要求较高,难以在临床实验室常规开展。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种跨学科的检测新技术,具有适应范围广、快速、准确、高通量、经济、操作方便等优势[3]。近几十年来,科研人员对MALDI-TOF MS技术在临床真菌的快速鉴定、药敏试验等方面不断探索和实践,在一定程度上弥补了传统形态学和分子测序技术上的不足。影响质谱鉴定真菌的因素比较复杂,尤其是丝状真菌,在培养条件、蛋白质提取方法、蛋白图谱数据库均不同的条件下,鉴定结果具有较大差异,仍需进行改进和完善[4]。本文基于近几年来MALDI-TOF MS技术在临床真菌鉴定和诊断中的应用进展,总结出不同检测条件对鉴定结果的影响,旨在为临床实验室实施MALDI-TOF MS技术鉴定真菌提供相应信息。

1 培养条件对MALDI-TOF MS技术鉴定真菌的影响

丝状真菌受生长条件和真菌菌丝体区域的影响,呈现出可变的表型。菌龄、培养基种类、培养条件等均可能会导致蛋白质谱差异,干扰样品的正确鉴定。有研究显示,来源相同的尖孢镰刀菌株,在两种不同琼脂培养基平板温度为25 ℃的环境下生长1周,蛋白质谱具有明显差异,随着时间的推移,即使在含有相同培养基的琼脂平板上,也会对蛋白质谱产生影响,特别是蛋白质峰的相对高度[5]。丝状真菌的孢子和菌丝体具有不同的生物相和蛋白质图谱,在采集固体培养基上的丝状真菌样品时,二者往往被同时采集,进而影响鉴定结果。布鲁克系统建议用液体培养基培养丝状真菌,因为液体培养基中丝状真菌分离物主要是菌丝体,可以提高蛋白质谱质量。但由于液体培养基存在雾化孢子污染风险和无法可视化宏观和微观表型特征的缺点,临床实验室仍然以直接从固体培养基中收集真菌样品为主,以简化样品制备过程并节省时间。

对于酵母菌,使用不同的培养基同样会对MALDI-TOF MS技术的鉴定对数评分值有明显影响[6]。一般而言,采用MALDI-TOF MS技术分析的菌落,应选择已经经过所用检测系统制造商验证的培养基,以提高鉴定结果与数据库的匹配度,保证鉴定质量。总之,用户应了解制造商推荐的培养基优、缺点及其孵育条件,以提高MALDI-TOF MS技术鉴定真菌的性能。

2 标本制备对MALDI-TOF MS技术鉴定真菌的影响

对MALDI-TOF MS技术来说,标本制备及合适的蛋白质提取方法是影响鉴定灵敏度、分辨率和再现性的关键步骤。标本制备不当会导致较低的峰分辨率,影响鉴定结果。基于MALDI-TOF MS技术的丝状真菌鉴定在过去几年受到限制,主要原因是缺乏高效的样品制备方法来保证高质量的蛋白质谱。与细菌不同,真菌可以通过简单的预处理方法快速准确地获得鉴定结果,而真菌的传统预处理方法,特别是丝状真菌则更为复杂,涉及乙醇、甲酸、乙腈等试剂和离心等提取过程,不同丝状真菌蛋白质提取方法对质谱鉴定结果的影响差异较大。

HONSIG等[7]根据MALDI-TOF MS技术制造商提供的3种不同标本制备方法,比较各自在鉴定丝状真菌物种水平的识别率,结果显示,液体培养有效识别率最高(76.1%),优于细胞裂解法(62.0%)和完整细胞法(48.9%)。除制造商推荐的样本制备方法外,在临床工作中,广大科研人员也不断探索和开发出了许多新的样本制备方法。PENG等[8]描述了一种更方便、省时、省试剂、灵敏的预处理方法:甲酸夹层法。使用安图生物质谱仪的Autof MS系统时,甲酸夹层法能够实现93.9%的物种级鉴定;当临床库、科研库、内部数据库结合使用时,使用梅里埃公司的VITEK MS系统能实现97.3%的物种级鉴定。NING等[9]创建了两种快速提取丝状真菌蛋白质的方法:氧化锆-二氧化硅磁珠法(ZSB)和聚焦超声法(FUS),并使用VITEK MS系统评估了两种方法的识别精度。按制造商推荐的常规蛋白质提取方法,VITEK MS系统物种级正确鉴定率为76.42%,ZSB和FUS物种级正确鉴定率分别为79.67%和76.42%。按制造商推荐的常规蛋白质提取程序,每个丝状真菌预处理时间至少需要30 min,而ZSB和FUS分别将每份标本的操作时间减少至7 min或5 min,每个额外的菌株只需多出几秒,从而节省了大量时间。

通常,实验技术人员采用的预处理方法和策略基于他们的经验或实验室标准操作规程,但这种模式可能会导致反复鉴定,给日常工作带来负担,造成时间、人员、耗材等成本的浪费。因此,实验人员需开拓思维,根据情况选择适当的分析前预处理方法,提高MALDI-TOF MS技术的鉴定效率和准确率。

3 数据库对MALDI-TOF MS技术鉴定真菌的影响

微生物数据库是MALDI-TOF MS技术鉴定的关键组成部分,菌株识别的准确率主要依靠菌株数据库的功能,尤其是新物种的鉴定对其依赖性更强。目前,在临床实验室主要的数据库有布鲁克公司的Biotyper系统、梅里埃公司的VITEK MS系统和安图生物公司的Autof MS系统等。现有的数据库均不够完善,临床真菌的鉴定准确率在不同系统之间存在一定差异。

有研究对各数据库中存在的菌株进行了评价,对于丝状真菌,Biotyper系统进行种、属或复合物的鉴定准确率为76.7%,高于VITEK MS系统的50.0%;对于酵母菌,Biotyper系统的鉴定准确率为82.9%,低于VITEK MS系统的93.3%。对于数据库中不存在的真菌,VITEK MS系统比Biotyper系统给出了更多的错误识别[10]。还有相似的研究也显示,Biotyper系统对酵母菌株物种水平的鉴定率稍逊于VITEK MS系统[11]。最近有研究评估了3种不同的MALDI-TOF MS系统在鉴定临床丝状真菌方面的表现,VITEK MS系统最具有优势,96.0%菌株鉴定到物种水平,98.4%到属水平;Biotyper系统42.1%菌株鉴定到物种水平,42.9%到属水平;Autof MS系统58.7%菌株鉴定到物种水平,60.3%到属水平[12]。在鉴定不同物种复合物内的酵母分离物方面,Autof MS系统比VITEK MS系统具有更高的鉴定准确性,在系统密切相关的物种复合物中鉴定不太常见的物种方面,VITEK MS系统的鉴定能力仍有待提高[13]。性能识别方面,Autof MS系统与Biotyper系统相当,但Autof MS系统在数据库中提供了更多的真菌物种级结果,测试时间大约是Biotyper系统的一半[14],在临床微生物实验室中,能够提供更高的通量。

在数据库的构建过程中,其覆盖范围、类型等至关重要。目前有很多机构致力于构建内部参考数据库,以提高MALDI-TOF MS技术对罕见的、新兴的或地方性真菌的识别率。MALDI-TOF MS技术自建库的构建需用数据库中没有的真菌分离株或物种不断扩展和更新,并用其他数据库或者方法相互验证。目前由于各实验室相对独立,不同自建库不能够共享,因此,开发可在线获取的参考频谱数据库十分必要。在线获取的参考频谱数据库的开发,能促进不同实验室间进行相互验证和补充,达到资源优化和共享,提高MALDI-TOF MS技术的诊断效率和拓宽应用范围。

4 MALDI-TOF MS技术在检测抗真菌药敏试验(AFST)方面的应用

现阶段,根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)和欧洲抗菌药物敏感试验委员会的指南,AFST的参考方法为肉汤稀释法,但这种方法需要较长的时间,会延误患者及时抗真菌治疗的时间。

基于MALDI-TOF MS技术,对AFST进行了两种相对较新的尝试:第一种是基于暴露在不同浓度抗真菌药物时真菌图谱的变化,根据得到的复合相关指数(CCI)作出推断[15]。第二种是基于MALDI Biotyper系统快速测定抗菌药物敏感性试验(MBT ASTRA),针对不同浓度的抗真菌剂确定感染因子的生长状况,并与提供相对生长比(RG)的无药物对照组比较,通过定义临界值且根据相应抗真菌浓度的RG,将病原体的生长量分类为易感或耐药[16]。

基于MALDI-TOF MS技术的AFST,目前没有广泛应用于临床真菌性疾病的诊断,各实验室仍处于探索研究阶段,一些研究通过CCI获得了很高的诊断值,但这些结果具有一定差异[17-18]。VATANSHENASSAN等[16]通过采用MBT ASTRA和CLSI指南推荐的肉汤稀释法,比较分析了对卡泊芬净耐药的白色念珠菌和光滑念珠菌的检测数据,验证了MBT ASTRA方法,结果显示,与肉汤稀释法比较,白色念珠菌MBT ASTRA检测的灵敏度和特异度均为100.0%;光滑念珠菌MBT ASTRA检测的灵敏度、特异度和有效性分别为94.0%、80.0%和95.0%[16]。KNOLL等[19]通过Meta分析,系统评价了基于MALDI-TOF MS技术检测酵母菌和丝状真菌对唑类和棘白菌素类抗真菌药物的耐药性,与肉汤稀释法比较,基于MALDI-TOF MS技术的耐药性检测具有91.1%的灵敏度和95.1%的特异度。MBT ASTRA方法的总体灵敏度达到96.0%,优于CCI的85.3%,两种方法的特异度相似,分别为93.2%和94.2%[19]。

AFST模式在物种之间可能有较大差异,因此,快速、可靠地鉴定真菌耐药性对患者管理及改善预后至关重要[20]。AFST常用方法的周转时间为24～48 h,MBT ASTRA周转时间在8 h以内[19]。因此,基于MALDI-TOF MS技术的AFST,有望成为临床实验室快速准确检测真菌耐药性的一种方法。

5 展 望

尽管MALDI-TOF MS技术在临床真菌诊断领域存在一定局限,但在过去几年中,MALDI-TOF MS技术具有的易用性、低耗时、低成本及高通量等特点改变了临床实践,为临床实验室诊断真菌感染做出了贡献。由于新病原体的出现及不断变化的微生物分类学的推动,未来的研究需进一步改进和扩展真菌参考数据库,优化培养和提取蛋白质的标准化操作程序,加强MALDI-TOF MS技术在真菌药敏试验、真菌菌株分型等方面的应用,实时探索临床真菌物种的演变多样性。总之,MALDI-TOF MS技术的发展为真菌病的临床和治疗管理提供了新方向,为个性化医疗提供了巨大潜力。