斑点叉尾鮰PCR鉴定方法

郑剑 曾宪东 周旋 王柘珉 邹彩娟

摘  要：该试验根据斑点叉尾鮰（Ietalurus punetaus）特异保守基因序列，设特异性实时荧光PCR引物和探针，建立实时荧光PCR快速鉴定方法，然后进行PCR反应特异性和灵敏性验证。结果表明，建立的实时荧光PCR检测方法简单、快速、灵敏度高，检测灵敏度可达到6.07×101copies/μL，具有较大的应用价值，为相关鱼类的肉制品源性鉴别提供了科学依据，适用于水产加工品贸易中斑点叉尾鮰的物种真伪鉴定，还可广泛应用于以水产检验及食品卫生检测等领域。

关键词：斑点叉尾鮰（Ietalurus punetaus）；PCR；成分鉴定

中图分类号：S965.1文献标志码：A

斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）全称美国斑点叉尾鮰，又称沟鲶、河鲶、美洲鲶，隶属真骨总目（Teleostei），有鳔首目（Ostariophysi），鲇形目（Siluriformes），北美鲶科（Ictaluridae），叉尾鮰属（Ictalurus）。其因适温范围广、生长快、抗病能力强、饲料转化率高，适于集约化和规模化养殖；而且其肉质鲜美，营养价值高，易于加工，一直深受养殖户和消费者喜欢。中国于1984年由湖北省水产研究所从美国引进斑点叉尾鮰，并于1987年人工繁殖成功，为发展商品养殖奠定了基础。并且随着在养殖过程中不断完善繁殖和养殖技术，90年代末开始鮰鱼养殖并已经初具规模。

2000年以后中国斑点叉尾鮰开始出口美国，随着2003年越南鲇鱼被美国定为倾销，美国的斑点叉尾鮰消费市场出现了较大缺口，中国的斑点叉尾鮰产品开始进入美国市场，并且出口量持续增长。但从2006年开始，美国对中国的鮰鱼产品实施了贸易壁垒，阿拉巴马州、密西西比州、路易斯安那州等美国本土鮰鱼主产区先后禁止中国鮰鱼产品入境。2007年美国FDA和FSIS要求对中国输美斑点叉尾鮰实施DNA检测及备案。自此中国鮰鱼对美出口受到极大限制，出口量大幅下降，回落到5914t，出口美国鮰鱼产品锐减50％以上。

常规的形态学鉴定方法并不适合斑点叉尾鮰加工产品的鉴定，为进一步提高斑点叉尾鮰鉴定能力，以应对国外贸易壁垒，以及预防和消除商业中的斑点叉尾鮰产品的掺假，该研究通过设计特异性引物进行PCR扩增，建立了斑点叉尾鮰分子生物学鉴定方法，大大提高了斑点叉尾鮰及其制品的鉴定能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

该实验中所用到的实验材料，斑点叉尾鮰、革胡子鲶、南方大口鲶、长丝巨鲇、鲤、红锦鲤、鳝、黄颡鱼、鳜、草鱼、鲫均从农贸市场、超市和网络平台购买。

1.1.2 主要试剂

广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；2×Taq PCR Mastermix购自天根生化科技（北京）有限公司、KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix（2×）Universal购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；引物与探针由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。

1.1.3 仪器设备

qubit4.0荧光定量仪（Thermo Fisher， 美国）；Veriti PCR仪（Thermo Fisher，美国），QuantStudio 7 Flex实时荧光定量PCR系统（Thermo Fisher， 美国）；5417R型高速离心机（Eppendorf， 德国）。

1.2 实验方法

1.2.1 引物设计

根据Gen Bank数据库中已公布的斑点叉尾鮰基因序列，使用 Clustal X 软件进行序列比对，筛选出种属相关的特异性保守序列，利用Primer3Plus设计特异性PCR引物和探针，引物和探针序列见表1。

1.2.2 DNA提取

所有动物样品参照广谱型基因组DNA小量纯化试剂盒中的操作说明提取DNA，用qubit4.0荧光定量仪检测DNA浓度及纯度。提取的DNA置于-20℃保存。

1.2.3 标准质粒的构建

根据Gen Bank数据库中已公布的斑点叉尾鮰基因保守序列，进行PCR扩增，将扩增获得的基因序列克隆至pUC57载体，构建标准重组质pUC57-PI。根据以下公式计算重组质粒拷贝数：拷贝数（copies/μL）=6.02×1023×。

1.2.4 PCR方法的建立

普通PCR擴增体系和反应条件如下：2×Taq PCR Mastermix 12.5μL，引物（10μm）各1μL，模板2μL，dd H2O补足至25μL；95℃预变性5mins，然后35个循环为95℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸45s，最后72 ℃延伸5mins。实时荧光PCR扩增体系和反应条件如下：KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix（2×）Universal 12.5μL，引物（10μm）各1μL，探针0.51μL，模板2μg，dd H2O补足至25μL；95℃预变性5mins，然后40个循环为95℃变性10s，60℃退火40s。

1.2.5 特异性验证

为了验证本实验方法的特异性，分别使用斑点叉尾鮰、革胡子鲶、南方大口鲶、长丝巨鲇、鲤、红锦鲤、鳝、黄颡鱼、鳜、草鱼、鲫的基因组DNA作为模板进行PCR扩增反应，分析引物的特异性。

1.2.6 灵敏度验证

将质粒标准品 DNA 从起始39.5μg/mL开始进行 10 倍比稀释，选择 8 个梯度进行灵敏度实验，以无菌ddH2O为空白对照，进行PCR扩增，分析检测的绝对灵敏度，每个反应设置 3 个平行。

2 结果与分析

2.1 特异性分析

由圖1可知， 除斑点叉尾鮰有明显的扩增曲线外，其他物种均为阴性结果，表明所设计引物和探针均具有很好的特异性。

2.2 荧光PCR灵敏性分析

随着模板拷贝数的降低，扩增曲线起飞时间逐渐下降，见图2，当应质粒DNA拷贝数浓度为6.0×101copies/μL时，仍有明显的扩增曲线出现，表明该检测方法的灵敏度可以达到6.0×101copies/μL，相对常规PCR灵敏度提高了3个数量级，如图3。

2.3 实时荧光PCR检测方法的应用

对实验室收集以及市场购买的20份样品进行实时荧光PCR检测， 结果显示，实时荧光 PCR检测方法从20份测试样品中检出3份阳性，实时荧光PCR 检测方法与常规PCR的检测结果完全一致，表明建立的斑点叉尾鮰实时荧光PCR检测方法准确可靠且更快速。

3 讨论

2003年越南鲇鱼被美国封杀后，曾经借道中国，以中国斑点叉尾鮰的标签转道继续再次进入美国市场，且随着中国出口斑点叉尾鮰数量的急剧增长，对美国本土鮰鱼养殖和加工业形成了巨大的生存压力。从2007年下半年开始，美国FDA在对中国输美斑点叉尾鮰在实施批批扣检的基础上，要求对产品实施DNA检测，以验证加工原料是否为从美国引进的原种斑点叉尾鮰鱼，以杜绝越南鲇鱼（巴沙鱼）借道中国出口至美国，而美国FSIS则对斑点叉尾鮰以及其产品进行强制性的DNA备案，供查验。除此以外，市场上龙利鱼、巴沙鱼和斑点叉尾鮰均以鱼片的产品形式进行销售，其产品在形态上相互都难以区分，市场上以巴沙鱼冒充斑点叉尾鮰，或以巴沙鱼和斑点叉尾鮰冒充龙利鱼牟取暴利的情况也层出不穷。这种违法行为不仅逃避税收，损害国家利益，而且破坏了水产品贸易的公平性，也损害了消费者的合法权益，甚至带来食品安全问题。

该研究基于斑点叉尾鮰基因组特异保守序列设计特异性引物和探针，建立了斑点叉尾鮰荧光PCR源性成分分析检测的方法。试验证实，斑点叉尾鮰的引物和探针的特异性良好，荧光PCR的最低检测量达到6.0×101copies/μL，相对常规PCR灵敏度提高了3个数量级。该方法特异性强、灵敏度高，为水产食品企业实现产品质量把控提供了有效方法，为监管部门对水产食品行业进行监督管理提供了科学依据。

参考文献：

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PCR identification method for Italurus punetaus

ZHENG Jian， ZENG Xiandong， ZHOU Xuan， WANG Zhemin， ZOU Caijuan

（Wuhan Customs Technology Center， Wuhan  430050， Hubei China）

Abstract：This experiment was conducted to establish a rapid real-time fluorescent PCR identification method based on specific conserved gene sequences of Italurus punetaus with specific real-time fluorescent PCR primers and probes， followed by validation of the specificity and sensitivity of the PCR reactions. The results showed that the established real-time fluorescence PCR method is simple， rapid and sensitive， with a sensitivity of 6.07×101copies/μL， which is of great application and provides a scientific basis for the identification of the origin of meat products of the relevant fish species. It can also be widely used in the fields of aquatic inspection and food hygiene testing.

Keywords：Italurus punetaus; PCR; Component identification