基于精气阴阳学说释意细胞自噬与卵巢储备功能减退发生的相关性

郑 伟,薛 玲,郑 敏,于 潇,刘金星

(1. 山东青岛中西医结合医院,山东 青岛 266002;2. 枣庄市中医医院,山东 枣庄 277000;3. 山东中医药大学附属医院,山东 济南 250014)

卵巢是女性重要的生殖腺,卵巢内原始卵泡的储备反映了女性的生殖和内分泌潜能,遗传、年龄、社会心理、药物及手术创伤等因素会引起卵巢储备功能减退(diminished ovarian reserve,DOR)。DOR引起的月经模式紊乱、生育能力降低及不良妊娠结局等问题严重困扰着育龄女性的生殖内分泌功能。近年来本病低龄化趋势显著增加,其发病率约占卵巢疾病的20%[1]。随着细胞自噬学说的深入研究,越来越多的学者认为DOR的发生与颗粒细胞(granulosa cells,GCs)自噬活性异常引起的卵泡异常募集和闭锁相关[2-3]。以调节细胞自噬为基点,探讨不同药物治疗DOR的药效学研究是目前DOR实验研究的热点。多数中医学者认为DOR的病机是肾虚,临床辨治本病从补肾填精入手以平调肾中阴阳[4]。笔者研读中医基础理论,认为细胞自噬的过程和DOR的发生符合精气、阴阳学说的理论要点。本文拟以中医基础理论释意细胞自噬为出发点,运用传统的中医学概念来解释现代分子生物学的知识,且浅议中医药调控细胞自噬治疗DOR的研究现况,以期为中医药治疗DOR提供新的理论依据及参考思路。

1 细胞自噬对DOR发生的影响

DOR的发生以卵巢内卵母细胞的数量减少和(或)质量下降为主要特征,这与卵泡过度闭锁和异常募集相关[5]。氧化应激(oxidative stress,OS)条件下,GCs自噬活性的异常引起卵泡的异常募集和发育损伤,可能是引起DOR发生的机制之一[6]。

1.1GCS自噬对卵泡发育的影响 卵泡的生长发育是卵母细胞、GCs及卵泡膜细胞相互作用的结果。其中,GCs环绕着卵丘和卵泡膜内壁,其形态和功能的变化影响着卵母细胞和卵泡膜细胞的生长和分裂。另外,GCs参与性激素的合成与分泌,调控卵巢内细胞因子(如激活素A、抑制素B)的表达,对卵泡的生长发育起着重要的作用。GCS自噬对卵泡的发育有两种作用机制:一是保护性自噬,即基础的细胞自噬有助于维持原始卵泡的数量、生殖细胞的存活以及去除黄体残留[3];二是死亡性自噬,即高水平的细胞自噬诱发原始卵泡的提前募集及生长卵泡的异常闭锁。Delcour等[6]认为自噬相关蛋白(autophagy-related protein,ATG)ATG7和ATG9A的缺失会引起自噬体生物合成减少,进而出现自噬功能受损,影响原始卵泡的保存和卵巢储备。邵童[7]通过mRNA表达芯片分析发现DOR患者GCs中存在着自噬缺陷,该缺陷一方面阻碍了GCs的分化进程,另一方面影响GCs损伤后的增殖和修复能力,引起GCs的过度衰老,导致卵泡的提前闭锁。

1.2OS是GCs自噬的主要原因 OS是细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)大量累积后破坏机体的氧化还原平衡,引起脂质、蛋白质、DNA等生物大分子的氧化损伤。卵巢GCs中性类固醇的生物合成需要大量能量消耗,细胞内会产生高水平的ROS,生殖过程中加速的代谢率也会产生大量的氧自由基,因此,有学者认为OS诱导的GCs过度自噬是引起卵泡异常闭锁和DOR发生的主要驱动力[8]。生理环境下,ROS的产生和清除处于动态平衡状态,GCs分泌大量的始基卵泡活化抑制因子(如bFGF、GDF-9、BMPs、FOXOs),抑制卵泡的过度募集,使卵泡池内原始卵泡数量维持在正常范围[9]。然而发生OS时,生长卵泡不能进行成熟分裂而过度自噬或凋亡,会直接或间接损伤卵巢原始卵泡池的储备。究其原因,一方面,始基卵泡缺少卵泡抑制因子调控,始基卵泡的激活和募集过度增加,另一方面过度的ROS活性会引起耐受力弱的始基卵泡直接凋亡[10]。高强氧化应激状态下,为了保护快速减少的始基卵泡,卵巢自噬活性过度增加,通过不同的信号途径触发细胞自噬性死亡。

1.3调节细胞自噬水平可以缓解GCs的异常凋亡目前研究证实褪黑素(melatonin,MT)、白藜芦醇、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone,FSH )等制剂可以通过减轻OS引起的GCs自噬性损伤,减少GCs的异常凋亡。MT是一种强大的抗氧化剂,通过上调其他抗氧化酶的活性直接或间接地清除ROS。Xie等[11]实验证实MT通过下调ERK途径缓解了线粒体和卵巢储备功能的损伤,防止过度自噬导致的抗苗勒管激素表达下降、细胞周期停滞和线粒体膜电位的损伤。李琰珉[12]实验证实:通过血清饥饿法体外诱导GCs自噬,加入MT干预后可以通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制自噬相关蛋白的表达,继而抑制GCs自噬,增加原始卵泡和生长卵泡的数量,减少闭锁卵泡。Yong等[13]实验结果显示,有机磷农药马拉硫磷(Malathion)暴露诱导的OS会引起卵巢生殖功能损伤,其中使卵巢组织中ROS增加,GCs自噬增加,小鼠动情周期明显紊乱,而白藜芦醇通过调节PI3K/AKT信号通路活性减轻卵巢组织的毒性,激活下游抗氧化酶活性,降低GCs的氧化应激,抑制卵泡GCs的过度自噬。Shen等[14]研究了FSH对小鼠GCs自噬的影响,结果发现FSH可以抑制OS诱导的GCs自噬作用。FSH干预后可以阻断缺氧诱导因子1-a减弱自噬信号,显著抑制MAP1LC3B-Ⅰ向MAP1LC3B-Ⅱ的转化、mTOR去磷酸化、SQSTM1降解和BECN1表达,进而改善体内OS条件下的巨自噬/自噬的通量受损。

2 中医基础理论释议DOR与细胞自噬

中医学认为宇宙的一切事物都是由精或气构成的,而相互关联的事物或同一事物内部又存在着阴、阳两个相互对立又相关的方面。用中医基础理论释议DOR与细胞自噬,一方面细胞自噬符合中医学精气学说及阴阳学说的基本内容,另一方面DOR的发生存在着精气、阴阳失调的基本病机。

2.1中医基础理论释议自噬

2.1.1精气学说与自噬 精气学说是研究宇宙生成及世界本原的学术思想,认为世界万物的生成皆是精气自身运动的结果;精气通过不停的升、降、聚、散的运动,使得自然界在无形之气及有形之体之间不断地变化;精气维系着天地万物的相互联系,使事物之间相互感动,相互作用。《周易》记载“精气为物”;《管子》记载“一气能变曰精”;《素问·六微旨大论》记载“非升降则无以壮老矣,非出入则无以化收藏”。

自噬起源于希腊文“autophagy”,原意是“自己吃掉自己”。自噬虽然需要通过荧光显微镜或透射电镜来验证,但纵观其全过程,在不同方面都体现着精气的特性。①物质性:精气是占有一定空间的精微物质;自噬以一定物质结构存在于细胞内;如透射电镜下吞噬泡呈双层或多层膜结构的新月状或杯状,有包绕胞浆成分的趋势;自噬小体是双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分;自噬溶酶体为单层膜结构,胞浆成分已降解。②弥散性:精气弥散连续、无处不在;自噬作为Ⅱ型程序性死亡的方式广泛地存在于真核细胞内,依赖溶酶体途径自我清除受损的、衰老的细胞器和不需要的大分子物质,以实现细胞自身的代谢需求。③能动性:精气处于永恒的自发运动中;自噬也是一个动态的过程;自吞噬体(双层膜结构)包裹待降解的细胞器(线粒体、内质网),与胞内体融合形成自体吞噬泡,由溶酶体降解吞噬泡转运的内容物,变成可溶性的小分子物质进入细胞质基因继续参与细胞的物质代谢[15]。④关联性:精气是天地万物相互联系的中介;自噬与凋亡、焦亡等其他细胞死亡方式共同存在,相互调控并参与疾病的发生发展。如实验证实:大脑中动脉闭塞模型大鼠脑缺血再灌注后12 h内细胞自噬和凋亡同时被激活,而在2 d后可能存在从细胞凋亡到自噬的转换[16];H9C2心肌细胞在缺氧复氧损伤过程中细胞自噬、焦亡、凋亡同时存在,其中自噬被抑制,细胞焦亡及凋亡增加[17]。

2.1.2阴阳学说与自噬 阴阳学说是用“阴”和“阳”两个对立且相关的属性概括自然界相互关联的事物或现象,并阐释事物发生、发展、变化的思维方法。阴阳两个方面既对立制约又相互为用,在消长变化中可以相互转化,在不断运动中相互作用维持着自然界的协调平衡。《素问·阴阳应象大论》记载:“阴阳者,天地之道也,万物之纲纪,变化之父母,生杀之本始,神明之府也。”

用阴阳学说释议细胞自噬,源于细胞内环境与细胞自噬之间,以及自噬运动本身都不是静态不变的,而是属阴和属阳的两个方面相互制约、相互为用、相互消长的结果。①对立制约:笔者认为细胞自噬与细胞内环境是相互对立、相互约束的,表现出阳胜阴退、阴强阳弱的动态联系。其中,细胞内环境是有形的、短期内相对静止和内守的,属阴;而自噬的发生是无形的、运动的、兴奋的,属阳。自噬本身是个推陈出新的过程,其中降解废弃的蛋白质和受损的细胞器的过程相对衰退、下降、抑制属阴,而产生氨基酸、核苷糖酸的过程相对亢进、上升、兴奋属阳。②互根互用:自噬以细胞内环境为载体,是细胞自身防御和应激的调控机制;自噬通过消除、降解或消化受损、变性、衰老的细胞器及变性蛋白质,可以实现细胞器自我更新,维持细胞内环境的稳定性。生理状态下,细胞内存在着低水平的基础性自噬,以维持细胞自身结构的稳定性。当机体受到外源性刺激或机械损伤时,细胞自吞噬活性增加,诱发保护性自噬。③消长平衡:细胞的自噬水平是随着机体的动静状态及细胞因子调控水平而消长变化,代谢后大分子物质生成氨基酸、核苷糖酸被细胞重新利用,为细胞的功能活动提供能量,使细胞内环境及自噬进程均保持着相对的动态平衡,即“阴平阳秘”。然而当细胞受到持久或过强的刺激,细胞自噬水平过度增高或相对不足时,或者调节信号因子调控细胞自噬相对异常时,破坏了细胞内环境及细胞自噬的动态平衡,则出现“阴阳失调”的病理变化。如卵巢GCs自噬缺陷可能会造成GCs基础状态异常或应激损伤后细胞稳态维持障碍,引起了DOR、PCOS等疾病的发生[18]。邵童[7]研究发现DOR患者不仅存在GCs自噬缺陷,而且GCs的自噬水平较低。马智等[19]通过皮下注射脱氢表雄酮制备PCOS模型大鼠,通过透射电镜及细胞学检测证实:PCOS 模型大鼠卵巢GCs中同时存在细胞增殖率降低和过度自噬的现象。张光云等[20]研究发现卵巢过度刺激后,通过诱导ROS的累积而引起保护性自噬的发生,自噬和Nrf2蛋白可以同时发挥抗氧化作用、抑制GCs的凋亡。

2.2DOR的中医学病因病机 中医学没有“卵巢储备功能减退”的记载,但此证符合清·傅山《傅青主女科》“年未老经水断”的论述 。此外,该病引起的月经异常、生育能力下降的表现归属于中医学“血枯”“血滞”“经闭”“无子”等范畴。现代学者多认为DOR的发生与肾中精气亏虚密切相关,存在肾阴、肾阳的虚衰,病位在冲任胞宫,变化在气血,表现为经水渐断,胎孕难成[21]。

肾中所藏的精气,不仅是构成和维持人体生命活动的物质基础,也是月经的产生和胎孕进程的关键因素。古代医家多认为“经水出诸肾”(《傅青主女科》),“经候不调,病皆在肾经”(《妇人规》),“肾者,主蛰,封藏之本,精之处也”(《素问·六节藏象论》)。女性生殖机能的盛衰以肾为主导,若肾精充盛,天癸成熟,冲任气血满溢胞宫,则“月事以时下,故有子”;然肾精虚衰,天癸枯竭,冲任气血衰少,经断其流,则“地道不通,形坏而无子”。

肾藏精,精化气,气分阴阳,肾中精气阴阳对于卵子的发育成熟起着重要的作用。卵泡是肾中所藏之“阴精”,肾阴是其生长发育的物质基础,肾阳是其充盛排出的动力。肾中精气充盛,肾阴濡润卵泡使其不断地生长发育至成熟,肾阳温煦卵泡并鼓动推进其排卵,施泄为生殖之精。然先天不足、后天失养、房事不节、大病失养或经产不慎等因素消耗肾中精气。肾虚精亏,冲任虚衰,女性年未至七七而出现月水不行、胎孕不成,甚至早绝经症状。

因此,中医药辨治DOR多在补肾填精的基础上兼以辛温祛寒、滋阴清热,调补肾中阴阳,促进卵泡的生长发育和顺利排出。陆海美等[22]崇“女子阴常不足”的理论,认为DOR系肾阴不足,天癸乏源所致,冲任气血亏虚,则难以化生经血,卵泡生长发育迟缓,而致月经过少、稀发甚至闭经。李善霞等[23]认为DOR的病机是肾阴涸乏、气血亏虚,治宜补肾养阴、益气养血,以左归丸为基础方加减治疗本症,可以显著改善DOR患者肾阴虚的临床症状和卵巢储备功能,降低FSH和E2水平,增加窦卵泡数量,改善生育功能。王娜娜等[24]认为本病系肾中阳气亏虚,下焦虚寒所致,无法温煦冲任气血,阳虚不能鼓动肾中精气蒸腾气化,影响卵母细胞的质量,阻碍卵泡顺利排出。江涵等[25]认为DOR的发生与肾阳不足、冲任衰少相关,毓麟珠能补肾助阳益精,连续给药6个月可以有效降低血清FSH和FSH/LH水平,提高E2水平,恢复患者的月经周期。

3 中医药调节细胞自噬治疗DOR的研究进展

近年来,许多学者将细胞自噬与中医学相联系,从不同的角度探究中医药干预对细胞自噬的调节作用和对疾病发生的影响。以细胞自噬调控卵泡发育为切入点,是目前探讨中医药治疗DOR的新的研究方向。孙晓彤[26]实验证实:二仙汤温肾阳、泻肾火,通过调节自噬相关基因的表达干预GCs的自噬过程,进而有效减少环磷酰胺诱导的DOR模型大鼠的卵泡闭锁,增加各级卵泡数量,并改善黄体发育。朱芳芳等[27]研究发现:麒麟丸可以保护环磷酰胺诱导的DOR模型小鼠的卵巢储备,抑制始基卵泡的过度激活,减少卵泡闭锁,该药补肾健脾,益气养血,负向调节细胞的自噬水平,抑制卵巢内细胞的过度自噬。孙晓峰等[28]探讨左归丸对磷酰胺氮芥(phosphoramide mustard,PM)诱导损伤的卵巢GCs影响及作用机制。实验中发现,大鼠卵巢GCs被30 μmol/L的PM干预后,GCs的自噬水平显著升高,进而诱导GCs的凋亡,而10%左归丸含药血清可以通过抑制GCs自噬/溶酶体降解途径,减轻GCs的凋亡。白俊等[29]研究雷公藤甲素(triptolide,TP)诱导卵巢GCs自噬所需的浓度、时间,结果显示:浓度为100 nmol/L的TP作用GCs 8 h后产生自噬现象,作用12 h后成功诱导自噬的发生。该过程是通过抑制PI3/AKT/m TOR信号通路调控自噬相关基因的表达实现的。复方新加归肾丸可以通过激活 PI3K/AKT/m TOR 通路,下调自噬效应分子Beclin1、 LC3 的表达并减少 p62 的消耗来修复 TP导致的大鼠卵巢 GCs 的自噬损伤[30]。现代药理学研究也充分证实:杜仲总黄酮可能通过激活PI3K/AKT/mTOR通路参与卵巢组织细胞自噬,降低PCOS大鼠GCs的自噬水平,进而减少囊状扩张卵泡,降低血清AMH、LH、T的水平,增加黄体,升高FSH水平[31]。淫羊藿素亦通过激活PI3K/Akt通路抑制PCOS大鼠GCs的凋亡和自噬,提高Gs的增殖率,细胞增殖活性与药物浓度成正比[32]。

从肾论治DOR不仅可以使肾中精气充盛,促进生殖功能的恢复,还可以和调五脏气血,从多系统、多靶点、多环节调节整体功能[33]。纵观细胞自噬的功能活动,亦是通过细胞内的物质交换和自我更新实现机体阴阳气血的平衡协调,根据感邪轻重及属性,治以扶正祛邪、调整阴阳。《素问·至真要大论》谓“客者除之,劳者温之……损者温之”,补肾填精有助于提高DOR患者肾-天癸-冲任-胞宫的生殖功能,改善卵巢储备,以至“正胜邪退”。补肾的同时,亦应注重调整机体阴阳的盛衰及气血的失调。“谨察阴阳所在而调之,以之平期”,从调补肾阴肾阳着手,阳生阴长,则肾精自足。调理气血要明辨疾病在气、在血、属虚、属实的不平衡状态,使气血和顺,冲任调达。

4 小 结

细胞自噬广泛存在于真核细胞内,可以通过溶酶体途径实现细胞内的自我更新,对于卵泡的发育和闭锁有着重要的作用。本文首次从中医基础理论释意细胞自噬为出发点,探讨细胞自噬与DOR发生发展的联系。笔者认为自噬过程体现着精气学说及阴阳学说的主要内容,而且DOR的发生也存在着精气阴阳的失调。然而,目前相关中医药通过调控细胞自噬治疗DOR的作用机制和中医检测指标尚不完全明确,还缺乏清晰的临床研究资料。因此,正确理解细胞自噬与中医学的联系,有利于开展中医药通过细胞自噬参与卵泡发育及卵巢储备功能的调节,对于中医药治疗DOR提供新的研究方向。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。