基于网络药理学方法挖掘中药治疗卵巢功能减退的研究进展

刘 洋,韩布威,葛 航,罗 蓉,王 宇,,吴效科

(1. 黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;2. 黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040)

卵巢作为性腺器官对女性一生都至关重要,主要分泌雌孕激素以及少量的雄激素。卵巢储备功能减退(diminished ovarian reserve,DOR)、早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency,POI)以及卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是女性常见的内分泌疾病。根据陈子江等[1]在《中华妇产科杂志》上发表的共识中指出DOR的概念为卵母细胞的数量减少和(或)质量下降,同时伴有抗缪勒管激素水平降低、窦卵泡计数减少、FSH 水平升高。POF和POI在临床表现上基本没有区别,常指女性40岁之前出现月经稀发或闭经,伴有高FSH及低雌激素。主要区别在于FSH水平诊断标准不同,POI的2次FSH水平>25 IU/L(间隔4周以上),而POF的2次FSH水平>40 IU/L(间隔4周以上)[2]。卵巢功能减退是一个渐进的过程,DOR、POI和POF本质上都是卵巢功能减退,DOR是POI的先兆,POF是POI的终末阶段。临床上治疗卵巢功能减退大多数采用激素替代疗法(Hormone replacement therapy,HRT),但并不能从根本上改善卵巢功能,长期应用会增加骨质疏松、冠心病和各种癌症等风险[3]。网络药理学作为近年来一门朝阳学科[4],在2007年由英国药理学家率先提出,随着人工智能以及大数据时代兴起。网络药理学符合中医整体观念,它基于各大数据库来整合资源,从系统层次和生物网络的整体角度解析中药用药规律,为中药复杂体系研究提供可视化分析便于理解。近年来利用网络药理学来探究中药治疗卵巢功能减退的作用机制受到广泛关注,本文搜集并对2篇单药、2篇药对、15篇中药复方相关文献进行总结和归纳,对进一步探讨中医药治疗卵巢功能减退提供参考。

1 单味中药治疗卵巢功能减退的作用机制

1.1紫河车 童鑫等[5]获得紫河车活性成分16个,721个靶点,作用于POF的靶点共342个。包括17-β-雌二醇、乙醇胺、雌三烯、8-脱氧-14-脱氢-Aconosine、醛固酮等有效成分,其中黄体酮的作用靶点最多,占535个靶点,17-β-雌二醇320个靶点,雌三醇268个靶点,雌酮266个靶点。得出紫河车具有丰富的甾体激素,有广泛的治疗意义,如抗炎、抗过敏、改善代谢功能等方面,通过调节性腺轴的负反馈来降低FSH水平。筛选出紫河车治疗POF的关键靶点,涉及E1A结合蛋白P300(EP300)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT1)、肿瘤蛋白质P53(TP53)、CREB结合蛋白(CREBBP)、丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、雌激素受体1(ESR1)等。这些靶点可能通过PI3K-Akt/mTOR、cAMP、MAPK等信号通路发挥对类固醇激素反应、对肽激素反应、腺体发育、脂质代谢过程的调节等生物学作用。PI3K-Akt/mTOR信号通路广泛存在于细胞中,参与细胞的生长、增殖和分化,有研究表明电针可以激活PI3K-Akt/mTOR信号通路,降低通路蛋白的磷酸化,使血清抗苗勒激素(AMH)、雌二醇(E2)、卵泡生成激素(FSH)、黄体生成激素(LH)水平恢复,具有保护卵巢提高生育的功能[6]。黄体酮与FSH协同通过PI3K/AKT和MAPK信号通路调节卵泡生长,MAPK和PI3K/AKT信号通路在黄体酮介导的颗粒细胞增殖抑制和卵泡生长调节中起着关键作用[7]。FSH通过PKA、PI3K、AKT p38-MAPK和ERK1/2等信号通路调节卵泡颗粒细胞的生长和分化,在体内和体外实验中证实了FSH可以通过PI3K/AKT途径下调P53上调凋亡调节因子(PUMA)重组蛋白的表达,从而抑制活性氧诱导的细胞凋亡[8]。

1.2淫羊藿 Zhao等[9]收集到淫羊藿共23个主要成分,筛出19个主要成分符合不同中药成分的特点,包括木犀草素、白藜芦醇、淫羊藿A/C/E、脱水淫羊藿素等。雄激素受体(AR)、雌激素受体1(ESR1)、ESR2、激酶插入结构域受体(KDR)、细胞色素P450家族19亚家族A成员1(CYP19A1)和雌激素相关受体γ(ESRRG)被选作淫羊藿治疗卵巢早衰的关键靶点。GO富集分析主要涉及血管内皮生长因子受体信号、类固醇生物合成过程、内皮细胞增殖正调控、转录正调控、DNA模板、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录正调控等生物学过程。KEGG信号通路涉及13条通路,主要有类固醇激素生物合成、催乳素、甲状腺激素、癌症、雌激素等信号通路,淫羊藿治疗POI主要依赖激素调节相关的信号通路。由此可知淫羊藿通过多种途径作用于多种POI靶点。

2 中药药对治疗卵巢功能减退的作用机制

2.1菟丝子-枸杞 李锦英等[10]筛选出菟丝子-枸杞共42种有效成分,其中菟丝子总黄酮、槲皮素和β-谷甾醇均可促进卵巢颗粒细胞产生雌激素[11]。构建活性成分-疾病靶点网络图得到degree值,其中最大的为槲皮素,其次为山柰酚、谷甾醇、异鼠李素、黄豆黄素、豆甾醇、芝麻素等。槲皮素具有抗炎、抗氧化、减少卵巢组织氧化损伤等保护卵巢作用[12]。β-谷甾醇和豆甾醇都具有雌激素样活性作用于卵巢颗粒细胞[13]。核心靶点有AKT1、TP53、VEGFA、IL-6、TNF、CASP3共6个靶点,这些靶点作用于癌症、乙型肝炎、PI3K/AKT、MAPK、FoxO等信号通路发挥改善卵巢生长发育、颗粒细胞的增殖分化、卵母细胞的生长过程来发挥治疗POF的作用。基于miRNA靶向基因的分析表明,FoxO信号通路和细胞衰老是最丰富的信号通路[14]。FoxO信号通路的多种成分参与了颗粒细胞的凋亡和POI的发病机制[15]。总之菟丝子-枸杞药对具有治疗卵巢功能减退的作用。

2.2仙茅-淫羊藿 胡长容等[16]筛选出仙茅-淫羊藿药对共有30个活性成分、228个相关靶点,主要活性成分包括淫羊藿中的槲皮素、木犀草素、山柰酚等,筛选出AKT1、IL-6、TP53等靶点作用于癌症途径、AGE-RAGE、IL-17、PI3K-Akt、细胞凋亡、HIF-1、NF-κB等信号通路。NF-κB信号通路在不同类型细胞的DNA损伤反应和凋亡中起着重要作用[17]。通过NF-κB、p53和p38信号通路可以减轻DNA损伤和细胞凋亡[18]。HIF-1信号通路与雌激素受体的表达呈正相关,可能直接作用于卵巢[19]。表明“仙茅-淫羊藿”药对具有治疗卵巢功能减退的作用。

3 中药复方治疗卵巢功能减退的作用机制

3.1二仙汤 二仙汤由仙茅、淫羊藿、巴戟天、知母、黄柏和当归共6味药组成,伍娟娟等[20]发现有92种活性化合物主要包括豆甾醇、山柰酚、β-谷甾醇、木犀草素、淫羊藿苷元、槲皮素等,PTGS2、HSP90AA1、ESR1、NR3C1、MAPK14可能是二仙汤治疗POF的作用靶点。利用DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析得到的条目比较少,GO富集分析涉及调节钠离子转运、多巴胺的分解过程、炎症反应中细胞因子产生的调节等,KEGG分析得到催乳素信号通路、孕激素介导的卵母细胞成熟、雌激素信号通路、VEGF信号通路等。李敏等[21]还发现GO分析涉及氧化应激反应、类固醇激素反应、对脂多糖的反应、对细菌炎性分子的反应等生物过程,KEGG涉及PI3K-AKT、MAPK、TNF以及糖尿病中并发症AGE-RAGE等信号通路。与李煜等[22]的研究结果有相似之处,将槲皮素、木犀草素、山柰酚和脱水淫羊藿素与核心靶点RB1、TP53、CDKN1A和AKT1做分子对接,结果具有较好的结合活性。由此可证实了二仙汤具有多成分-多靶点-多途径作用于卵巢。

3.2桃红四物汤加味 桃红四物汤加味由白芍、黄精、丹参、桃仁、地黄、山茱萸、川芎、当归和枸杞子共9味药组成,Yuan等[23]收集到247个药物靶点以及754个POF相关靶点,GO分析包括正向调节途径受限的SMAD蛋白磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、对药物的反应、Smad蛋白信号转导、DNA模板转录的正向调控等生物学过程。KEGG通路富集分析包括经TGF-β、foxO、卵巢类固醇激素合成、TNF、催乳素、细胞凋亡、PI3K-Akt、T细胞受体、类固醇激素生物合成、缺氧诱导因子-1、细胞因子-细胞因子受体相互作用、神经营养因子、p53、NF-κB等信号通路。并用动物实验验证能显著促进POF小鼠TGF-β-1/Smads信号通路的传递,从而促进颗粒细胞的增殖和分化。

3.3五子衍宗丸 钟静文[24]研究得出五子衍宗丸中枸杞子、菟丝子、覆盆子、五味子、车前子,共68种活性成分,243个相关靶点。前5位成分和靶点分别有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、鞣花酸、黄豆黄素以及PR、NCOA2、环氧合酶2、PPARs、转录因子p65,将主要成分和核心靶点进行分子对接,结果显示大部分结合活性较好。通过交集靶点进行KEGG通路富集分析涉及癌症途径、AGE-RAGE、IL-17等信号通路发挥类雌激素样作用、调节免疫、减缓卵巢衰老等作用。

3.4当归补血汤 Liu等[25]筛选出当归和黄芪共21个活性成分,312个相关靶点,获得了592个作用于POF的靶点,交集靶点共36个。槲皮素和山柰酚作用于TP53、IL-6、ESR1、AKT1和AR等关键靶点。GO富集分析有活性氧代谢、线粒体释放细胞色素C、细胞凋亡信号通路等生物学过程;内质网和线粒体等细胞成分;芳香酶活性和类固醇结合等分子功能。KEGG分析有p53、PI3K-Akt、雌激素、卵巢类固醇激素生成等信号通路。主要成分与核心靶点作分子对接具有良好的结合能力。并用动物实验发现当归补血汤及其活性成分可能通过调节TP53-AKT信号通路中ESR和AR的平衡来治疗POF。

3.5归肾丸 归肾丸由熟地、当归、杜仲、山茱萸、枸杞、茯苓、山药、菟丝子组成,邵芷若等[26]在TCMSP数据库中筛出120个活性成分,闫菲等[27]还收集了TCMIP和BATMAN-TCM数据库多加了42个活性成分,排名在前5位的活性成分和靶点分别有槲皮素、豆甾醇、山柰酚、β-胡萝卜素和表儿茶素以及TP53、AKT1、MMP9、ASP3、IL-6。GO分析涉及细胞对化学刺激的反应、对有机循环物的反应、相同蛋白结合和激酶结合等,KEGG分析涉及TNF、PI3K-Akt、FoxO、Toll、VEGF、MAPK和凋亡相关等信号通路。归肾丸治疗POF发挥雌激素样、抗炎、氧化应激和凋亡等作用。

3.6更年春加味 Gao等[28]通过动物模型推测更年春加味可以改善卵巢AMH和FSH受体的蛋白表达,更年春加味组方包括茯苓、巴戟天、淫羊藿、黄柏、枸杞子、菟丝子、龟板、柴胡、当归、川芎、生地、黄连、知母、白芍、苁蓉15味中药,共244个活性成分、267个药物靶点、186个与疾病交集的靶点。对交集靶点进行GO分析包括对刺激的反应、生物调节、代谢过程、多细胞生物过程、细胞交流、发育过程、细胞成分组织、细胞增殖等生物学过程;细胞组成中膜是最丰富的;分子功能中有蛋白质结合、离子结合和分子转导活性等。更年春加味可能是通过PI3K-Akt通路介导PTGS2、PTGS1、PGR等靶点在改善慢性应激诱导的卵巢储备方面具有良好的效果。

3.7滋癸益经汤 滋癸益经汤由菟丝子、枸杞、人参、淫羊藿、熟地黄、丹参、柴胡组成。杨益雯等[29]得到167个活性成分以及278个靶点,67个与POF交集的靶点。组方中含有菟丝子-枸杞药对,进一步验证了槲皮素、木犀草素、山柰酚等调节HIF-1、FoxO、P53、PI3K-Akt等信号通路作用于IL-6、AKT1、TGFB1、TNF等多个靶点,参与抗氧化应激、原始卵泡激活等作用。

3.8麒麟丸 麒麟丸由何首乌、墨早莲、淫羊藿、菟丝子、锁阳、党参、郁金等药物组成。Li等[30]筛选出麒麟丸中49个活性成分与POI有关,主要有黄酮类、酚酸类、三萜类和单萜类。KDR、EGFR、PIK3CG、AKT1和VEGFA等多个靶点是麒麟丸治疗POI的关键靶点。KEGG富集分析得到癌症中的途径、癌症中的蛋白多糖、MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、乙肝和内分泌耐药等。又用动物实验验证了麒麟丸可抑制MAPK和PI3K-AKT信号通路的过度激活,减缓了卵泡枯竭的过程。朱芳芳等[31]也用动物实验得出麒麟丸可能调控HIF-1α/Bnip3/Beclin1信号通路保护卵巢功能。

3.9滋肾育胎丸 滋肾育胎丸由滋菟丝子、砂仁、熟地黄、人参、桑寄生、阿胶、首乌、艾叶等药物组成。Feng等[32]挖掘出滋肾育胎丸共205种化合物、476个靶点。主要涉及基因表达负调控、端粒维持、病毒过程、染色体蛋白质定位调控、蛋白质代谢过程、蛋白质定位于细胞器等生物学过程。涉及病毒致癌、HIF-1、肝细胞癌、细胞周期、剪接体和核糖体途径等通路。滋肾育胎丸具有抗炎抗氧化以及参与葡萄糖代谢等作用,预测可能调控HIF-1信号通路作用于NFE2L2、NOX4等多靶点治疗卵巢炎症以及减缓卵巢衰老。

3.10寿胎丸 寿胎丸由菟丝子、续断、桑寄生、阿胶组成,筛选得到共21个活性成分,其中桑寄生、菟丝子的共有成分槲皮素和阿胶的成分赖氨酸是治疗POI的主要活性成分,精氨酸、芝麻素起辅助作用[33]。可能通过HIF-1、PI3K-AKT、炎症性肠病、精氨酸生物合成、JAK-STAT 信号通路等作用于CAT、EGF、NOS3、JUN等核心靶点发挥抗氧化、抗细胞凋亡、拟雌激素样作用延缓卵巢衰老。赖氨酸可能通过对LH分泌的中枢作用间接影响卵泡的发育和质量,精氨酸、芝麻素等还需进一步研究。

3.11四物汤 王鹍鹏等[34]筛选出四物汤中共20个主要活性成分,217个作用靶点,HRT筛选出283个靶点,POI相关2 724个靶点。四物汤和HRT治疗POI的GO分析共同表现在对药物的反应、对缺氧的反应、雌激素和类固醇的作用上,KEGG分析共同在类固醇生物合成通路上,另外提示可能对癌症也有治疗效果,得出结果四物汤可以作为HRT的替代方案,体现中医同病异治的治疗原则。四物汤具有抗氧化活性,促进卵巢颗粒细胞增殖和卵泡发育,还可能与恢复肠道菌群稳态有关,与雌激素受体的作用还需要进一步研究[35-36]。

3.12左归丸 左归丸中有熟地黄、枸杞、山茱萸、菟丝子、山药、川牛膝、龟板胶、鹿角胶。曾丽华等[37]筛选出83个左归丸的活性成分,181个左归丸治疗POI的共有靶点。预测了药物可能通过调控癌症、TNF、FoxO、PI3K/Akt、MAPK等信号通路和TP53、TNF、AKT1、JUN、CDKN1A等相关靶点促进卵泡的发育成熟发挥治疗POI的作用。

3.13左归饮 陈衎等[38]探讨了左归饮“异病同治”的网络药理学研究,筛选出左归饮(熟地黄、枸杞、山萸肉、山药、茯苓、炙甘草)共127个活性成分,有槲皮素、山柰酚、柚皮素、刺芒柄花素、甘草查尔酮 A,薯蓣皂素等。预测可能通过HIF-1、Hepatitis B、FoxO、癌症等信号通路作用于TP53、STAT3、TNF、AKT1、IL-6等核心靶点治疗POI、绝经综合征及闭经等。左归饮发挥抗氧化、抑制细胞凋亡、拟雌激素样作用刺激原始卵泡和卵母细胞的生长发育,维持其正常生理功能。

3.14癸源煎 癸源煎组方中含有熟地黄、仙灵脾、枸杞子、菟丝子、肉苁蓉、鸡血藤、香附。王月娇等[39]通过HPLC技术从癸源煎中分离出金丝桃苷、甜菜碱、松果菊苷,地黄苷D、淫羊藿苷、儿茶素,α-香附酮未被检测出。数据库中挖掘出癸源煎中共131个活性成分、330个作用靶点,与DOR相关靶点取交集得到60个重要靶点,其中核心靶点为IL-4、EGFR、MYC、VCAM1。这些靶点作用于糖尿病并发症、HIF-1、TNF、C型凝集素受体、FoxO、T细胞受体通路、P13K-AKT、内分泌抵抗等信号通路来调节颗粒细胞增殖和凋亡。

3.15补肾健脾方 补肾健脾方中共熟地黄、山茱萸、枸杞子、山药、茯苓、人参、白术、甘草8味中药。朱景茹等[40]检索出补肾健脾方有159个活性成分、62个与疾病相关靶点,包括山柰酚、柚皮素、槲皮素、薯蓣皂苷元、β-谷甾醇等主要活性成分,AKT1、VEGFA、CASP3、IL-6、EGF被筛选为核心靶点,作用于HIF-1、P13K-AKT、AGE-RAGE、IL-17、TNF以及各种癌症等相关的信号通路。补肾健脾方通过多种生物学过程和分子功能改善卵泡的发育状况。最后将主要活性成分与核心靶点进行分子对接进一步验证研究中预测的结果,显示分子对接结果良好,证明了补肾健脾方多成分-多靶点-多通路治疗卵巢功能减退。

4 总 结

中国传统医药逐渐走上国际舞台,近些年来利用网络药理学探讨药物治疗疾病的作用机制呈现井喷状出现,一系列程序化操作简便易行,较适合临床工作者以及在读医学生等。但随之而来的问题越来越多,网络药理学存在文章质量良莠不齐、“槲皮素类现象”层出不穷、未体现中医药“个性化”精准用药、数据限制于各大数据库、数据使用欠规范等问题,多数网络药理学文章尚处于初级阶段,缺乏强有力的证据验证,是否在临床中有指导意义还需要进一步研究[41-42]。为保障该学科在大环境下健康发展,2021年世界中医药联合会公布了《网络药理学评价方法指南》,是首个用于中医药领域网络药理学评价的标准,它为网络药理学提供了规范化评价标准、营造了健康有序的规范体系、推动了新一代药物研究范式更加严谨科学普适[43-44]。总之,网络药理学在中医药现代研究中具有巨大潜力,随着数据库不断完善、多学科相互交融、借鉴各个领域发展的最新结果才能更真实、准确地描述中药与疾病的关系网络。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。