冰箱贮藏鸡胸肉微生物变化规律

胡海梅 江峰 陈开松 李泓利 贾雯

摘 要：冰箱是保存食品的常用设备，其低温条件可有效延长食品的贮藏期，延缓食品的腐败变质，也在很大程度上保留了食品的营养物质。但在低温条件下仍有部分嗜冷、耐冷微生物可以存活甚至生长繁殖，是人们感染食源性疾病的可能来源。本文以鸡胸肉为研究对象，经过在冰箱中不同温度条件下的短期贮藏，通过微生物多样性检测和微生物分离纯化测序，分离鉴定出在低温下仍可生存的微生物，其中包括可能的致病微生物，以期为肉类食品在冰箱贮藏过程中的食品安全问题研究提供参考。

关键词：冰箱；低温；鸡胸肉；微生物；食源性疾病

Microbial Changes in Chicken Breast Stored in Refrigerator

HU Haimei1， JIANG Feng1， CHEN Kaisong1， LI Hongli2， JIA Wen2

（1.Changhong Meiling Co.， Ltd.， Hefei 230031， China; 2.School of Food Science and Nutrition Engineering， China Agricultural University， Beijing 100083， China）

Abstract： Refrigerator is a common equipment for preserving food， and its low temperature conditions can effectively extend the storage period of food， delay the deterioration of food， and also retain the nutrients of food to a large extent. However， under low temperature conditions， some cold-loving and cold-tolerant microorganisms can survive and even grow and reproduce， which is a possible source of food-borne diseases. This paper takes chicken breast as the research object. After short-term storage in the refrigerator at different temperatures， microorganisms that can survive at low temperatures， including possible pathogenic microorganisms， are isolated and identified through microbial diversity detection and microbial isolation and purification sequencing， in order to provide references for the study of food safety problems in the storage process of meat in the refrigerator.

Keywords： refrigerator; low temperature; chicken breast; microorganism; foodborne disease

溫度是影响微生物生长繁殖的重要因素之一。但在低温条件下，部分嗜冷、耐冷微生物仍能存活甚至生长繁殖，长时间贮藏也会导致食材品质劣变，一些致病微生物可能会引发食源性疾病[1]。鸡肉是最常见的肉类之一，是人们膳食结构中蛋白质、脂肪和磷脂的重要来源[2]。为进一步降低食材自身携带微生物给消费者带来的潜在危害，并提高食材的贮藏期限，了解在冰箱不同贮藏环境中食材携带的微生物种类尤为重要。因此，本文选用鸡胸肉进行短期贮藏，通过微生物多样性检测分析在冰箱不同温度条件下可存活的微生物种类以及优势菌种，以期为家用冰箱低温保鲜技术、低温杀菌技术等的开发与应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2022年6月至2022年8月在北京市海淀区3个大型超市（5份/超市）购买共15份鸡胸肉样品，在超净工作台中，将每份鸡胸肉品分成5份，分别放入5个无菌袋中，确保每个保鲜袋中的样品质量为25 g。将无菌保鲜袋封好后分别放置于常温（25 ℃）、4 ℃、?3.5 ℃、?18 ℃和?32 ℃条件下贮藏24 h。

1.2 仪器与试剂

LB固体培养基、酵母膏胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD）琼脂培养基，北京酷来搏科技有限公司；孟加拉红（Rose Bengal Chloramphenicol Agar，RBC Agar）培养基，上海申启生物科技有限公司；Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶，New England Biolabs公司；琼脂糖，美国Amresco公司；DC301凝胶回收试剂盒，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；T100? PCR仪，美国Bio-Rad公司；DYY-7C型电泳仪，北京市六一仪器厂；5424型高速离心机，德国Eppendorf公司。

1.3 试验方法

1.3.1 微生物的培养

将鸡胸肉样品在常温（25 ℃）、4 ℃、?3.5 ℃、?18 ℃和?32 ℃条件下贮藏24 h后取出，在超净工作台中待其解冻后用一次性无菌棉签取样棒蘸取样品不同部位浸出液，将棉签取样棒浸入25 mL无菌水中，使取下的微生物溶于无菌水中，重复20次上述操作制成混合微生物样品。将上述获得的25 mL混合样品加入盛有225 mL无菌水的锥形瓶中进行10倍梯度稀释，充分混匀，制成1∶10的样品匀液。再取1 mL的1∶10样品匀液注入含有9 mL无菌稀释液的15 mL灭菌管中，反复吹吸混匀，制成1∶100的样品匀液。重复上述操作程序至制备得到10-7梯度稀释液。

制备LB固体培养基、麦芽汁固体培养基和孟加拉红固体培养基，分别用于分离细菌、酵母菌和霉菌。选择2～3个适宜稀释度的样品匀液，每个稀释梯度分别吸取1 mL样品至上述3种选择性固体培养基表面，使用经过高压蒸汽灭菌的涂布器将样品均匀涂布至培养基表面，直至培養基表面干燥。同时分别取无菌水作为空白对照。细菌于37 ℃培养24～48 h，真菌（酵母和霉菌）于28 ℃培养48～72 h，培养过程中平板倒置。

1.3.2 微生物的分离纯化

本研究仅针对?18 ℃贮藏条件下样品中的细菌和真菌进行微生物的分离与纯化操作。选择适宜稀释梯度的平板（平板上有尽可能多的单菌落，同时不出现菌苔）进行分离操作，对该平板上每个单菌落采用平板划线法进行分离，并进行编号。对第1次分离得到的菌落按照上述操作挑取单菌落进行分离，直至完成微生物的纯化。将纯化后的菌株置于?80 ℃保藏，以备后续研究使用。

1.3.3 微生物的多样性检测和菌株鉴定

选择1.3.1中适宜稀释梯度的平板（菌落多且无菌苔），采用0.9%生理盐水（提前灭菌）进行平板洗脱，将洗脱的菌液收集于15 mL离心管中。对细菌的16S rRNA基因进行PCR扩增和测序，引物为27F和1429R[3]；对真菌进行ITS扩增子测序（ITS-1和ITS-4）[4]。引物序列如表1所示，真菌扩增片段为400～700 bp，细菌扩增片段约1 400 bp。PCR程序设置为预变性（94 ℃）5 min，变性（94 ℃）0.5 min，退火（58 ℃）0.5 min，延伸（72 ℃）1.6 min，最终延伸（72 ℃）10 min，循环30次。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增片段，用凝胶回收试剂盒回收和纯化目的片段。PCR产物送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行测序。利用SnapGene软件将DNA序列进行拼接校对后，在美国国立生物技术信息中心进行Blast检索，根据比对结果获得序列对应的种属信息。单个菌株的鉴定方法与此一致。

1.3.4 数据处理

使用DADA2[5]方法生成每个去重的序列应用安全验证标准（Amplicon Sequence Variants，ASVs），采用QIIME2的classify-sklearn算法[6-7]对每个ASV使用预先训练好的Naive Bayes分类器进行物种注释。根据ASVs注释结果和各样品特征表，获得物种丰度表。

2 结果与分析

2.1 冰箱不同温度贮藏环境中鸡胸肉携带微生物的多样性检测

鸡胸肉中共检测到184个细菌菌属。其中，在常温（25 ℃）条件下共检测到109个菌属，4 ℃条件下共检测到73个菌属，-3.5 ℃条件下共检测到94个菌属，-18 ℃条件下共检测到128个菌属，-32 ℃条件下共检测到82个菌属。在各温度条件下，巨球菌属（Macrococcus）和假单胞菌属（Pseudomonas）为主要的优势菌。在检测到的细菌Top30中，可能的致病菌属为8个。其中，共有常见致病菌属4种，条件致病菌属4种。假单胞菌属（Pseudomonas）在-18 ℃条件下丰度较高，葡萄球菌属（Staphylococcus）和不动杆菌属（Acinetobacter）在-32 ℃条件下丰度较高。

鸡胸肉中共检测到104个真菌菌属。其中，在常温（25 ℃）条件下共检测到70个菌属，4 ℃条件下共检测到64个菌属，-3.5 ℃条件下共检测到50个菌属，-18 ℃条件下共检测到77个菌属，-32 ℃条件下共检测到62个菌属。在各温度条件下，皮肤皮状新丝孢酵母属（Cutaneotrichosporon）为主要的优势菌。在检测到的所有真菌中，可能的致病菌数为2个，且均为常见致病菌。镰刀菌属（Fusarium）在-18 ℃条件下丰度较高。

2.2 鸡胸肉中分离纯化的微生物单个菌株的鉴定

将-18 ℃条件下短期贮藏鸡胸肉中的微生物通过选择性培养基分离、划线纯化等操作步骤，分离、纯化得到细菌（37个）和真菌（50个）。对细菌的DNA 16S V4区序列进行扩增测序，对真菌的ITS1区和18S V4区序列进行扩增测序。细菌和真菌的多样性分析结果均基于属水平进行分析与讨论。测序结果显示鸡胸肉样品中共分离出6株细菌、3株酵母菌和1株霉菌，如表2所示。

3 结论与讨论

本研究以鸡胸肉为研究对象，经过在冰箱中不同温度环境下的短期贮藏，通过微生物多样性检测和微生物分离纯化测序，分离鉴定出大量在低温条件下仍可生存的微生物，其中包括可能的致病微生物。目前的家用冰箱设备均以低温手段抑制微生物的生长或对某些不耐冷的微生物起到杀菌作用[8]，但研究表明简单的低温贮藏仍会使人们具有一定的感染微生物的风险。因此，需对冰箱合理分区、定期清洁冰箱、及时关注食材保存状态，从而预防食品受到微生物污染，保障人们的饮食安全。冰箱冷冻室贮藏的肉类食品含有各种耐冷微生物，可能导致冰箱冷冻室的污染，存在安全风险。本研究在-18 ℃条件下纯化的细菌和真菌可以作为开发冰箱冷冻杀菌方法的目标菌，具有潜在的应用价值。

参考文献

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