抑制核转录因子Gli1表达对人肺腺癌耐顺铂细胞株的顺铂耐药性逆转作用观察

达丽隽，王遵林，刘雅婷，刘进进，宋飞雪

1 兰州大学第二医院肿瘤内科，兰州 730030；2 兰州大学第二临床医学院；3 兰州大学第一医院内分泌代谢科

据统计，肺癌是引起全球癌症死亡的第一大病因［1］。由于缺乏典型症状及特异性筛查手段，绝大部分肺癌患者确诊时已属晚期，5年生存率不足20%［2］。肺癌患者中约有85%为非小细胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer， NSCLC），虽然针对驱动基因的靶向药物的应用显著提高了肺腺癌的临床疗效，但随之而来的耐药问题使患者的获益时间也仅能维持1年左右。因此，含顺铂的联合化疗仍然是晚期NSCLC的治疗基石。近年来，顺铂耐药已成为普遍现象，大大限制了肺癌的化疗疗效，如何有效逆转顺铂耐药性是目前肺癌领域研究热点。Hedgehog（Hh）信号通路在胚胎发育阶段发挥至关重要的作用［3］。随着研究深入，越来越多的证据［4］表明，Hh信号通路在肺癌中被异常激活，参与肿瘤增殖、分化、迁徙、转移、凋亡、耐药等过程。Smo作为Hh通路中重要的跨膜蛋白，负责细胞内信号传导和靶基因的激活，Smo抑制剂环杷明也常常作为Hh通路的阻断剂应用于多种研究，而通路下游的核转录因子Gli1则被认为是该通路过度激活的重要标志［5］。此外，研究［6］发现，Gli1基因的过表达除了受Hh信号通路调控外，还与磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphonoinositol 3 kinase/protein kinase B， PI3K/AKT）信号通路异常激活相关，这表明Hh信号通路与PI3K/AKT信号通路之间可能通过Gli1存在“串话”现象。信号通路间“串话”作用是指某一信号通路与其他信号通路在生物活动中相互联系，产生一系列复杂的生理效应，“串话”不仅表现在细胞信号强弱的调节、功能上的协同或拮抗，也可引起与原细胞信号通路完全不同的生物反应。2022年1月—2023年1月，我们观察了抑制核转录因子Gli1表达对人肺腺癌耐顺铂细胞株的顺铂耐药性逆转作用，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物及试剂 人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP购自上海瑞鹿生物公司；试验用药顺铂、环杷明（Smo抑制剂）、LY294002（PI3K抑制剂）、GANT61（Gli1抑制剂）购自美国Santa Cruz公司；RNAiso Plus（Total RNA提取试剂盒）、荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物公司；Gli1、β-actin引物由上海生物工程公司合成；Gli1、Bcl-2、Bax、MRP1、β-actin抗体购自美国Abcam公司；MTT细胞毒性检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自江苏碧云天公司。

1.2 细胞分组及药物给与 将A549/DDP细胞培养于含10%胎牛血清、青-链霉素各10 µg/mL的RPMI1640培养液中，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，每2～3 d传代1次。取对数生长期细胞，接种于6孔培养板上，待细胞融合达70%～80%时，将培养基更换为无血清培养基，并随机分为四组，分别为GANT61组、环杷明组、LY294002组、对照组，GANT61组加入10 µmol/L的GANT61，环杷明组加入10 µmol/L的环杷明，LY294002组加入20 µmol/L的LY294002，对照组加入培养基。各组细胞继续培养48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞用于后续实验。

1.3 各组细胞中Gli1 mRNA和蛋白检测

1.3.1 各组细胞中Gli1 mRNA检测 采用实时荧光定量PCR法。取各组细胞，采用RNA提取试剂盒，提取细胞总RNA，参照试剂盒说明书进行cDNA逆转录，以SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 µL，上、下游引物各1 µL，模板cDNA 2 µL，dH2O 8.5 µL的反应体系扩增Gli1基因，β-actin为内参照。Gli1上游引物：5'-CTGGACCTGCAGACGGTTATC-3'，下游引物：5'-AGCCTCCTGGAGATGTGCAT-3'；β-actin上游引物：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。扩增条件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s（40个循环），65 ℃延伸10 min。以2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。

1.3.2 各组细胞中Gli1蛋白检测 采用Western Boltting法。取各组细胞，用PBS洗涤细胞后，提取各组细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每组取40 µg蛋白，于Mini-PROTEAN TGX预制胶中行蛋白上样，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转至PVDF膜上，再经5%脱脂奶粉封闭1 h，加入相应一抗，一抗工作浓度分别为Gli1（1：1000）、β-actin（1：5000），4 ℃孵育过夜，次日洗膜后，以辣根过氧化酶标记的二抗（1：20000）37 ℃孵育1 h，再洗膜3次，按照ECL发光试剂盒说明书进行检测，Bio-Rad凝胶成像系统获取图像，使用Image J软件扫描灰度值，以灰度值表示各组细胞中Gli1蛋白的相对表达量。

1.4 各组细胞的顺铂耐药性观察

1.4.1 顺铂对各组细胞的半数抑制浓度（half maximal inhibitoryconcentration， IC50）测算 采用MTT法。取各组细胞，将细胞接种于96孔板上，每孔4×103个细胞，加入不同浓度顺铂（终浓度分别为1、2、4、8、16 µg/mL），设三个复孔，同时设置阴性对照孔和空白对照孔。作用48 h后，每孔加入5 mg/mL四甲基偶氮唑蓝（MTT）20 µL，继续培养4 h，加DMSO 150 µL/孔，震荡10 min，酶标仪570 nm处测定各孔的吸光度值，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线，计算顺铂对各组细胞的IC50值。

1.4.2 各组细胞中多药耐药相关蛋白（multidrug resistance-associated protein 1， MRP1）检测 参照方法“1.3.2”检测MRP1蛋白，其中一抗工作浓度为1：1000，以灰度值表示各组细胞中MRP1蛋白的相对表达量。

1.4.3 各组细胞凋亡率测算 采用Annexin V-FITC法。取各组细胞，向各组细胞加入顺铂（5 µg/mL）继续培养48 h，用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，加入PBS缓冲液轻轻震荡，将细胞重悬于200 µL的Binding Buffer，加入5 µL的Annexin V-FITC轻轻混匀，避光室温反应15 min，再加入5 µL的PI染色，室温避光孵育20 min后，使用流式细胞仪检测，使用Flowjo软件计算各组细胞凋亡率。

1.4.4 各组细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax检测参照方法“1.3.2”检测Bcl-2、Bax蛋白，其中一抗工作浓度为Bcl-2（1∶2000）、Bax（1∶1000），以灰度值表示各组细胞中Bcl-2、Bax蛋白的相对表达量。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料呈正态分布时以±s表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞中Gli1 mRNA和Gli1蛋白相对表达量比较 GANT61组、环杷明组、LY294002组、对照组细胞中Gli1 mRNA相对表达量分别为0.30 ±0.08、0.62 ± 0.12、0.68 ± 0.11、1.05 ± 0.10，其中环杷明组与LY294002组相比，P＞0.05；其余组间两两相比，P均＜0.05。GANT61组、环杷明组、LY294002组、对照组细胞中Gli1蛋白相对表达量分别为0.28 ± 0.12、0.59 ± 0.07、0.55 ± 0.13、0.97 ± 0.06，其中环杷明组与LY294002组相比，P＞0.05；其余组间两两相比，P均＜0.05。

2.2 各组细胞的顺铂耐药性比较

2.2.1 顺铂对各组细胞的IC50值比较 顺铂对GANT61组、环杷明组、LY294002组、对照组细胞的IC50值分别为（7.35 ± 1.03）、（9.86 ± 0.71）、（10.23 ± 1.02）、（14.26 ± 2.10）µg/mL，其中环杷明组与LY294002组相比，P＞0.05；其余组间两两相比，P均＜0.05。

2.2.2 各组细胞中MRP1蛋白相对表达量比较GANT61组、环杷明组、LY294002组、对照组MRP1蛋白的相对表达量分别为0.18 ± 0.09、0.38 ±0.17、0.58 ± 0.19、0.83 ± 0.24，组间相比，P均＜0.05。

2.2.3 各组细胞凋亡率比较 GANT61组、环杷明组、LY294002组、对照组细胞凋亡率分别为27.27 % ± 0.99%、15.45% ± 1.01%、12.35% ±1.80%、6.25% ± 0.38%，其中环杷明组与LY294002组相比，P＞0.05；其余组间两两相比，P均＜0.05。

2.2.4 各组细胞中Bcl-2、Bax蛋白相对表达量比较 GANT61组、环杷明组、LY294002组、对照组细胞中Bcl-2蛋白的相对表达量分别为0.15 ± 0.08、0.33 ± 0.15、0.63 ± 0.13、0.91 ± 0.19，组间相比，P均＜0.05。GANT61组、环杷明组、LY294002组、对照组细胞中Bax蛋白的相对表达量分别为1.88 ±0.38、1.34 ± 0.25、1.27 ± 0.39、0.64 ± 0.18，其中环杷明组与LY294002组相比，P＞0.05；其余组间两两相比，P均＜0.05。

3 讨论

Hh信号通路在1980年由NUSSLLEIN-VOLHARD和WIESCHAUS首次发现，它被证实参与调控果蝇幼虫身体节段的发育过程［7］。Hh信号通路主要由三种同源配体（IHh、DHh、SHh）、跨膜蛋白受体（Ptch、Smo）、核转录调控因子Gli家族及下游靶基因共同组成［8］。当通路激活时，Hh配体与其受体Ptch相结合，使Ptch对Smo的抑制作用得以解除，活化的Smo通过一系列信号传导过程激活核转录因子Gli家族。Gli蛋白家族有Gli1、Gli2、Gli3三个成员，三者均含有5个高度保守的锌指DNA结合结构域。由于Gli2和Gli3同时含有活化结构域和阻遏结构域，故二者既能激活下游靶基因，也可在一定程度上抑制靶基因的表达，而Gli1因缺乏阻遏结构域，在通路中仅发挥正向作用来调节靶基因的表达［9］。因此，学者们普遍将Gli1的上调视为Hh信号通路活化的标志。

顺铂是肺癌化疗中应用最广泛的细胞毒药物，除了能直接杀伤肿瘤细胞外，它还可以有效诱导肿瘤细胞发生凋亡。然而由于肿瘤耐药性的产生，使其疗效不尽人意。常见的肿瘤耐药机制学说有肿瘤微环境、肿瘤上皮-间质转化、免疫逃逸、表观遗传以及肿瘤耐药信号通路代偿等。由于上述学说中均有Hh信号通路的参与，所以该通路已成为研究肿瘤耐药机制的重要靶点。KONG等［10］研究证实，Hh信号通路通过调控EMT因子的表达来参与人类髓性白血病细胞耐药性的产生。GIROUX等［11］在对36例NSCLC患者的研究中发现，12例化疗耐药患者中Gli1的表达水平显著高于非耐药组。将Hh信号通路抑制剂维莫德吉作用于顺铂耐药小细胞肺癌中，可显著提高癌细胞对顺铂的敏感性，增加细胞凋亡比例［12］。因此，我们推断通过抑制Hh信号通路可能会逆转NSCLC耐顺铂细胞株A549/DDP的耐药性，为顺铂耐药患者提供新的治疗靶点。

PI3K/AKT信号通路在机体生长发育过程中同样发挥重要作用。PI3K是一类特异性催化磷脂酰肌醇物质的激酶，活化的PI3K可促进AKT磷酸化，使AKT从胞膜转移至胞核，进一步激活下游分子如mTOR、Bcl-2家族、S6蛋白激酶等，进而参与调控肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡等［13］。目前多项研究表明PI3K/AKT信号通路在促进肿瘤耐药性方面同样扮演重要角色。MRP是一种跨膜药泵，它可通过多种方式将化疗药物泵出细胞，从而降低癌细胞对化疗药物的敏感性。有研究［14］证实，在前列腺癌和急性粒细胞白血病中MRP1的表达依赖于P13K/AKT信号通路的异常激活。张劲远等［15］发现，PI3K/AKT通路能上调人大肠癌细胞hct-8/FU中P-GP蛋白的表达，提高细胞对氟尿嘧啶的耐药性。WANG等［16］将PI3K抑制剂作用于肺癌细胞，发现细胞对顺铂的敏感性显著增强，提示PI3K/AKT信号通路与肺癌顺铂耐药性之间可能存在密切联系。最新研究发现，Hh信号通路可与PI3K/AKT信号通路通过交叉调控现象促进肿瘤发生发展。在基底细胞癌中，PI3K下游分子S6K1和aPKC通过磷酸化Gli1来激活其转录活性，进而调控靶基因的表达，参与肿瘤多种生物学活动［17］。所以转录因子Gli1可视为这两条通路的关键交叉点。那么在肺腺癌中是否也存在这种相互关系？目前鲜有报道，并且其参与调控肺癌耐药性的具体机制也有待进一步阐明。

本研究中，我们以人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP为细胞模型，分别采用Smo抑制剂环杷明、PI3K抑制剂LY294002以及Gli1特异性抑制剂GANT61，观察比较这三种药物对Gli1的影响。结果显示三种抑制剂均能不同程度下调Gli1的表达，其中应用GANT61使Gli1的表达量下降最为显著。这证实了在肺腺癌中Gli1不但是Hh信号通路下游的核转录因子，受Hh信号通路直接调控，同时Gli1也受PI3K/AKT信号通路的调控，即Hh通路与PI3K/AKT通路之间存在“串话”关系。近年来，许多研究表明Bcl-2家族可通过拮抗肿瘤药物诱导的细胞凋亡效应参与肿瘤耐药性的产生［18］。此外，MRP1是目前公认的介导化疗药物外排导致多药耐药产生的主要蛋白之一［19］。在本研究中，我们发现随着Gli1被抑制，Bcl-2、MRP1的蛋白表达量明显下降，而Bax的蛋白表达量显著上调；MTT结果显示抑制Gli1可以显著提高顺铂对肺腺癌细胞的抑制率，最后，Annexin V-FITC凋亡实验进一步阐明了Gli1与肺癌顺铂耐药之间的关系，即抑制Gli1能提高顺铂诱导的细胞凋亡率，使A549/DDP细胞对顺铂的敏感性增强，从而逆转肺癌的顺铂耐药性。

综上所述，Smo抑制剂环杷明、PI3K抑制剂LY294002、Gli1抑制剂GANT61均可抑制A549/DDP细胞中Gli1的表达；抑制Gli1表达可通过降低顺铂对A549/DDP细胞的IC50、促进A549/DDP细胞凋亡，逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药性。与环杷明和LY294002相比，GANT61具有更高的拮抗效率，因此，GANT61有望成为肺癌靶点治疗领域的新策略之一。当然，肺癌细胞耐药性的产生是一系列极其复杂的过程，具体作用机理尚待进一步阐明，并且，针对Gli1靶点的抑制剂在临床中的进一步应用仍需进行大量更深入的研究。