SLC5A8基因敲除后皮下种植结肠癌细胞株的负瘤模型小鼠肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群占比观察

刘雅涵，吴育朔，赵泽满，蔡思源，靳小石

1 河北大学附属医院普通外科，河北 保定 071000；2 河北大学临床医学院

结肠癌是当前全球范围内发病率排名第三的肿瘤，且发病率更是在逐年增加［1］。在我国，结肠癌的发病率形势亦不容乐观，近十年来数据统计我国结肠癌的发病率在常见恶性肿瘤中位于第四位，仅次于肺癌、胃癌和肝癌。结肠癌作为生长迅速、恶性程度高、转移性强、死亡率高的恶性肿瘤，是最具侵袭性的肿瘤之一。SLC5A8基因位于人类染色体的12q13-23，与人体内多种组织器官肿瘤的发生发展有着密切联系，现已知其可在包括结肠肿瘤在内的多种肿瘤中诱导细胞凋亡，因此它已经被标记为肿瘤抑制基因［2-8］。T淋巴细胞亚群是一个具有多功能的细胞群体，分为CD3+、CD4+和CD8+多个亚群，维持机体正常的免疫应答。在肿瘤免疫中，T淋巴细胞亚群发挥着重要作用，对临床指导肿瘤的免疫治疗具有极其重要的理论意义和临床意义。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因构建重组中发挥了强大作用，该技术可利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因进行敲除。2022年10—12月，我们观察了SLC5A8基因敲除后皮下种植结肠癌细胞株MC-38的负瘤模型小鼠肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群占比变化，为结肠癌基因治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 结肠癌细胞株MC-38由河北大学附属医院中心实验室冻存于-80℃冰箱。RPMI Medium 1640 basic（1×）购自中国THermo Fisher Scientific公司，DNAse I、Collagenase IV均购自美国SIGMA公司，PBS购自碧云天有限公司，红细胞裂解液购自河北大学附属医院中心实验室。流式细胞仪购自美国BD公司，细胞计数仪购自睿钰有限公司，手持组织粉碎器购自美国Biospec公司，高速冷冻离心机购自美国Thermo公司，过滤器购自中国绍兴卫星医疗有限公司。

1.2 SLC5A8基因敲除方法 预先设计SLC5A8-gRNA1（GTCTCGGACAAGCCTAGACT）、SLC5A8-gRNA2（GGGAGGCTCTCGCACTATCC），进行卵细胞显微注射，将小鼠逐步传代并剪尾行PCR检测，产出SLC5A8-/-纯合型小鼠。以上小鼠均由北京维通达生物技术有限公司提供技术支持（许可证件编号：SCXK（京）2019-0002）。本研究选取均为雌鼠，8～12周龄，体质量为18～22 g，均饲养于河北大学医学部SPF级动物实验中心，维持室温在21～25 ℃，每天24小时进行高效的过滤换气，湿度维持在40%～60%，12 h光照、12 h黑夜，小鼠的食用饲料和所铺垫料均需经过高强度射线定时定量进行照射消毒灭菌，小鼠饲养方式均按照标准啮齿类动物饲养。每3天补足饲料及自来水并更换垫料，分笼饲养1周。小鼠的实验设计符合实验动物福利伦理要求，审批号：2020XS021，本实验符合动物实验3R原则。

1.3 小鼠分组及MC-38负瘤模型的制备 打开紫外线灯，对超净台照射消毒灭菌约30 min，再将含有1 mL MC-38细胞株悬液的冻存管放置在37 ℃水浴锅中缓慢摇晃解冻直至冰晶完全消失，将冻存管用75%乙醇擦拭消毒后转移到超净台内，加入4 mL的1640培养基混合均匀，1000 r/min离心4 min，弃去上清液，补加2 mL的1640培养基后吹打均匀，然后将混匀后的全部液体倒入培养瓶中过夜。第2天及时更换瓶内培养液，并检查细胞密度。当细胞密度达到80%～90%时即可进行传代培养。收集对数生长期的MC-38细胞，使用台盼蓝溶液对其进行染色后计数。将MC-38细胞悬液与台盼蓝混合均匀后滴至计数板上进行计数，调整细胞浓度至5×106/mL。分别取SLC5A8基因敲除型C57BL/6小鼠、普通C57BL/6小鼠各4只，记为实验组、对照组。将两组小鼠依次取出，在异氟烷吸入麻醉下固定放置于工作台上，对背部皮肤进行脱毛，再以75%的乙醇消毒背部皮肤，从MC-38细胞悬液中抽取0.2 mL悬液接种于小鼠右侧背部皮下区域，种植后约一周左右，小鼠的背部皮下便可见一直径2～5 mm、形状不规则、移动性尚可、界限清楚的质硬结节，视为模型制备成功。

1.4 各组小鼠肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群占比测算 采用流式细胞法。将两组MC-38负瘤模型小鼠肿瘤组织完整剖下后，去除外层皮肤与被膜，选取尽可能多的肿瘤组织，尽量避开中心坏死区，放置于含有10%胎牛血清的1640培养基的六孔板中。每孔放置1片流式滤膜，用剪刀剪碎肿瘤组织后用EP管充分研磨肿瘤组织，之后转移、裂解、水浴、离心、重悬、台盼蓝染色计数，以制备结肠癌组织的单细胞悬液。每只小鼠的单细胞悬液准备3个EP管，每个EP管加入2×106个细胞，再加抗体CD45和CD483进行染色。再次离心、重悬后，使用流式滤膜过滤到流式专用试管，应用流式细胞仪检测小鼠肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群的占比。

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0和GraphPad Prism8统计软件。计量资料呈正态分布时以±s表示，比较用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实验组小鼠肿瘤微环境中CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞占比分别为27.730% ± 2.861%、50.923% ± 4.823%、10.205% ±1.234%，对照组小鼠肿瘤微环境中CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞占比分别为40.790% ± 9.940%、58.355% ± 3.292%、22.950% ±1.948%，实验组小鼠肿瘤微环境中CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞占比均低于对照组（P均＜0.05）。

3 讨论

2002年，RODRIGUEZ等［9］发现并从人肾cDNA文库中克隆鉴定出一个编码610个氨基酸的基因序列，将其作为溶质转运蛋白（Solute carrier，SLC）第5家族的第8号成员，即SLC5A8。SLC5A8基因位于人类染色体的12q13-23，其编码的蛋白与钠离子高度耦联，主要作用底物为短链脂肪酸（Short fatty acids，SCFAs）类物质，如丁酸、丙酸、和丙酮酸等，以上物质均可作为组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，通过组蛋白乙酰化的作用而影响细胞的增殖，可以上调促凋亡基因和下调抗增殖基因而导致细胞凋亡［10］。故通常认定SLC5A8为候选抑癌基因。

GURAV等［11］研究提示，SLC5A8基因在结肠是通过膳食纤维的细菌代谢产物—丁酸盐作用于免疫系统，尤其是黏膜中的树突状细胞，进而发挥抗炎抗肿瘤作用。并且，SLC5A8基因与结肠内细菌分解产物—短链脂肪酸的转运过程有着密切关系。在肠道黏膜组织，尤其是在丁酸含量较高结肠黏膜组织中含量最多。在SIVAPRAKASAM等［12］对炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）的研究中显示，IBD的特征是由于宿主免疫系统和微生物群之间的共生关系被破坏而导致肠道慢性炎症。各种因素会改变肠道微生物群，导致生态失调，尤其是饮食和膳食纤维两个因素。细菌在结肠中发酵这些膳食纤维并产生SCFAs，其介导膳食纤维的抗炎抗肿瘤的作用。以上研究提示，SLC5A8基因表达产物在结肠组织中有优势分布的特点，从而证实了该基因对结肠癌的研究中具备更重要的意义。

然而，SLC5A8基因的研究大多限于临床标本的检测与观察，尚缺乏真正的实验证据来证明该基因的肿瘤抑制作用。因此，建立目的基因缺失的癌症模型是研究SLC5A8基因与结肠癌发生发展的相关性的关键。CRISPR/Cas9基因编辑技术的优越性与可靠性为我们提供了新的研究思路。其主要工作原理是CRISPR-derived RNA（crRNA）通过碱基配对与trans-activating RNA（tracrRNA）结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物可引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶点剪切外源性DNA，从而实现对基因的编辑［13-14］。本研究成功应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SLC5A8基因缺失动物癌症模型，为SLC5A8基因与结肠癌的体内实验研究提供了重要基础。

肿瘤微环境与肿瘤细胞之间的相互作用贯穿了肿瘤发展全过程，而且，以T淋巴细胞主导的免疫是肿瘤发生和发展过程中机体主要的细胞免疫方式［15］。T淋巴细胞是一个具有多功能的细胞群体，分为CD3+、CD4+和CD8+多个亚群，维持机体正常的免疫应答。其中，CD3+代表了所有外周成熟的T淋巴细胞，它的作用是协助T淋巴细胞抗原受体识别抗原提呈细胞上的主要组织相容复合物——抗原决定簇复合物［16-17］。CD4+和CD8+是两类重要的T细胞亚群，反映宿主的免疫调节能力。CD4+T细胞在抑炎因子的作用下，分化为调节性T细胞，主要介导肿瘤细胞对免疫系统的耐受［18］。CD8+T细胞可以在促炎因子的作用下分化为细胞毒性T细胞，可以加强机体对肿瘤细胞的杀伤作用［19］。本研究结果显示，与对照组相比，实验组小鼠肿瘤微环境中CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞占比均降低，表明敲除了SLC5A8基因的小鼠细胞免疫抑制程度增加，肿瘤微环境中免疫屏障功能进一步受损，癌细胞可能进一步发生免疫逃逸，肿瘤进而进一步生长和转移。

综上所述，与普通C57BL/6小鼠相比，SLC5A8基因敲除后皮下种植MC-38细胞的负瘤模型小鼠肿瘤微环境中CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞占比均下降。SLC5A8基因的缺失导致小鼠肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群的占比下降，可能进一步使细胞免疫屏障受损，促进结肠癌细胞的免疫逃逸，从而促进结肠癌的发生与发展，这为今后结肠癌基因治疗提供了一定的思路以及实验依据。