氧化应激环境下LncRNA MALAT1 对内皮细胞TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路的影响

纪海涛，赵颖馨，于锡巧，柴强，刘振东，张丛丛

随着老龄化加重，动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发病率逐年升高，其病变部位主要是血管壁［1］。血管内壁是由内皮细胞组成的，而内皮细胞在机体器官中广泛分布［2］；此外，其还可以充当血管壁的调剂器，释放血管活性物质，调节血管的舒张与收缩［3］。AS的主要病因是内皮细胞对氧化低密度脂蛋白胆固醇（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）的调控失衡［4］，而ox-LDL是氧化应激刺激低密度脂蛋白产生的，所以氧化应激是引发AS的重要因素。研究表明，Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）与AS的发生有关［5-6］。TLR4主要分布在内皮细胞表面，其被激活后可与髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）结合，从而激活MyD88依赖的信号通路，进而促进核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的活化及促炎因子的释放［7］。

近年来长链非编码RNA（long chain non-coding RNA，LncRNA）持续受到学者们的关注，而长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录物1（long chain non-coding RNA metastasis-associated lung adenocarcinoma tran 1，LncRNA MALAT1）作为LncRNA家族的一员，在细胞核中表达，具有高度保守性［8］。研究发现，LncRNA MALAT1在血管疾病中发挥作用，可以促进血管生成［9］，并且可以保护发生氧化损伤的内皮细胞［10］。但目前LncRNA MALAT1与TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的关系尚不清楚。为此，本研究使用过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）诱导氧化应激细胞模型，然后探究氧化应激环境下LncRNA MALAT1对内皮细胞TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响，以期为研究氧化应激导致AS等心血管疾病的机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验时间 本实验时间为2022年10—12月。

1.2 实验材料 人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）由山东省医学科学院提供；LncRNA MALAT1的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）购自上海吉码制药技术有限公司：TLR4抗体购自美国Abcam公司；MyD88抗体、NF-κB抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；Actin、LncRNA MALAT1、TLR4、MyD88、NF-κB的引物购自铂尚生物技术（上海）有限公司；反转录试剂盒和q-PCR试剂盒购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司；蛋白凝胶购自武汉博士德生物工程有限公司；CCK-8试剂购自MCE公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 将HUVEC置于含5%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的低糖DMEM培养液中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养2～3 d，待细胞贴壁且在培养皿中的覆盖率达80%左右时进行实验分组与处理。

1.3.2 H2O2诱导氧化应激细胞模型的最佳干预时间将HUVEC悬液接种在96孔板中（100 μl/孔），将培养板放在培养箱中预培养6～8 h，将其分为A、B、C、D组，分别使用600 μmol/L的H2O2处理0、6、8、10 h，随后采用CCK-8法测定细胞活性，具体方法为：用PBS清洗掉残留的培养液和H2O2，再向每孔加入10 μl CCK-8试剂与90 μl低糖DMEM培养液，将培养板置于培养箱内孵育1～4 h，采用酶标仪测定450 nm处的吸光度。以细胞活性为60%时的时间作为本实验的最佳干预时间，实验独立重复3次。

1.3.3 q-PCR检测LncRNA MALAT1表达水平 将密度为30×104/ml的HUVEC均匀接种至6孔板中，每孔加入2 ml，培养12 h，将其分为对照组（不做任何处理）、H2O2组（使用600 μmol/L的H2O2处理8 h以构建氧化应激细胞模型），采用q-PCR检测LncRNA MALAT1表达水平，具体方法为：弃去培养基，用PBS清洗1遍，加入500 μl的Trizol以提取细胞中的总RNA，将总RNA吸出并移至EP管，加入200 μl双重去离子水（double distilled water，ddH2O），放入常温离心机进行离心，条件为6 720 r/min、15 min（离心半径为6 cm）；吸出上层清液（300～500 μl），加入等量异丙醇后再次离心，条件为6 720 r/min、10 min（离心半径为6 cm）；弃去液体，用75%乙醇溶液清洗，再次离心，条件为4 480 r/min、3 min（离心半径为6 cm）；弃去乙醇溶液后，加入ddH2O以溶解沉淀的LncRNA MALAT1。按照50 ℃ 15 min，75 ℃ 5 min的条件对提取出的LncRNA MALAT1进行反转录。以Actin为内参，使用PCR试剂盒对Actin、LncRNA MALAT1进行PCR扩增，加入0.4 μl上/下游引物、2.0 μl cDNA、10.0 μl PCR试剂，用ddH2O将总反应体系补齐到20.0 μl。PCR反应条件：94 ℃ 90 s，94 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，共30个循环；72 ℃ 5 min。Actin的上游引物序列为5'-GAAGAGCTACGAGCTGCCTGA-3'，下游引物序列为5'-CAGACAGCACTGTGTTGGCG-3'；Lnc RNA MALAT1 的上游引物序列为5'-GGATTCCAGGAAGGAGCGAG-3'，下游引物序列为5'-ATTGCCGACCTCACGGATTT-3'。根据公式（ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因）计算LncRNA MALAT1表达水平。实验独立重复3次。

1.3.4 Western blot法检测TLR4、MyD88、NF-κB表达水平 将密度为30×104/ml的HUVEC均匀接种至6孔板中，每孔加入2 ml，培养12 h，将其分为对照组（不做任何处理）、H2O2组（使用600 μmol/L的H2O2处理8 h以构建氧化应激细胞模型）、H2O2+siRNA组（转染LncRNA MALAT1的siRNA后使用600 μmol/L的H2O2处理8 h以构建氧化应激细胞模型），采用Western blot法检测TLR4、MyD88、NF-κB表达水平，具体方法为：弃去培养基，用PBS清洗1遍，加入200～300 μl RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂的混合液（1∶100），于冰上孵育5～10 min，用刮刀将细胞刮离六孔板并转移至EP管内，每个样本进行超声破碎3次，5 s/次；将其转移到4 ℃的离心机中，12 000 r/min离心15 min（离心半径为6 cm）；用移液枪吸取上清液，采用BCA法测量蛋白浓度，加入5×Buffer（与提取蛋白样本量的比例为1∶4），置于干式恒温器煮蛋白（100 ℃ 10 min）；添加10～15 μl的样品并将其置于蛋白凝胶中电泳1 h，电压保持在80 V；将蛋白转移到PVDF膜，转模方式为湿转，时间1 h，电压保持在100 V；将含有蛋白的PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭90 min；用1×TBST清洗3次，5 min/次；加入TLR4、MyD88、NF-κB抗体（稀释比例分别为1∶500、1∶1 000、1∶1 000），于4 ℃孵育6～8 h；于室温下用1×TBST清洗3次，5 min/次；用相应种属二抗孵育1 h（稀释比例为1∶5 000），用1×TBST清洗3次，5 min/次；进行蛋白显影，分析目标蛋白表达水平。实验独立重复3次。

1.3.5 q-PCR检测TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平 将密度为30×104/ml的HUVEC均匀接种至6孔板中，每孔加入2 ml，培养12 h，将其分为对照组（不做任何处理）、H2O2组（使用600μmol/L的H2O2处理8 h以构建氧化应激细胞模型）、H2O2+siRNA组（转染LncRNA MALAT1的siRNA后使用600 μmol/L的H2O2处理8 h以构建氧化应激细胞模型），采用q-PCR检测TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平，方法同1.3.3。TLR4的上游引物序列为5'-TGGATCAAGGACCAGAGGCA-3'，下游引物序列为5'-GAGGACCGACACACCAATGA-3'；MyD88的上游引物序列为5'-AAGCGACTGATCCCCATCAAG-3'，下游引物序列为5'-TCGCAGACAGTGATGAACCTC-3'；NF-κB 的上游引物序列为5'-TCTTTGACAAT CGTGCCCCC-3'，下游引物序列为5'-CAGCCIGGTC CCGTGAAATA-3'。

1.4 统计学方法 采用SPSS Statistics 26软件进行数据分析。计量资料以（±s）表示，两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H2O2诱导氧化应激细胞模型的最佳干预时间 A、B、C、D组细胞活性分别为（1.00±0.00）、（0.77±0.05）、（0.61±0.09）、（0.52±0.04）。四组细胞活性比较，差异有统计学意义（F=40.08，P=0.001）；B、C、D组细胞活性均低于A组，差异有统计学意义（P＜0.05）。C组细胞活性最接近60%，故H2O2诱导氧化应激细胞模型的最佳干预时间为8 h。

2.2 对照组与H2O2组LncRNA MALAT1表达水平比较H2O2组LncRNA MALAT1表达水平为（0.76±0.25），低于对照组的（1.28±0.38），差异有统计学意义（t=2.776，P=0.020）。

2.3 对照组、H2O2组、H2O2+siRNA组TLR4、MyD88、NF-κB表达水平比较 对照组、H2O2组、H2O2+siRNA组TLR4、MyD88、NF-κB表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；H2O2+siRNA组TLR4、MyD88、NF-κB表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；H2O2+siRNA组MyD88、NF-κB表达水平高于H2O2组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

图1 Western blot法检测对照组、H2O2组、H2O2+siRNA组TLR4、MyD88、NF-κB表达水平的电泳图Figure 1 Electropherogram of TLR4，MyD88 and NF-κB expression levels in control group，H2O2 group and H2O2+siRNA group detected by Western blot method

表1 对照组、H2O2组、H2O2+siRNA组TLR4、MyD88、NF-κB表达水平比较（±s，n=3）Table 1 Comparison of expression levels of TLR4，MyD88，NF- κB in control group，H2O2 group，H2O2+siRNA group

表1 对照组、H2O2组、H2O2+siRNA组TLR4、MyD88、NF-κB表达水平比较（±s，n=3）Table 1 Comparison of expression levels of TLR4，MyD88，NF- κB in control group，H2O2 group，H2O2+siRNA group

注：H2O2=过氧化氢，siRNA=小干扰RNA，TLR4=Toll样受体4，MyD88=髓样分化因子88，NF-κB=核因子κB；a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与H2O2组比较，P＜0.05

组别TLR4MyD88NF-κB对照组0.72±0.210.41±0.140.74±0.07 H2O2组0.95±0.390.52±0.141.01±0.23 H2O2+siRNA组1.27±0.44a0.84±0.23ab1.37±0.24ab F值4.8411.5112.66 P值0.0190.0010.001

2.4 对照组、H2O2组、H2O2+siRNA组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平比较 对照组、H2O2组、H2O2+siRNA组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；H2O2组TLR4、MyD88 mRNA表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；H2O2+siRNA组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平高于对照组、H2O2组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 对照组、H2O2组、H2O2+siRNA组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平比较（±s，n=3）Table 2 Comparison of mRNA expression levels of TLR4，MyD88，NFκB in control group，H2O2 group，H2O2+siRNA group

表2 对照组、H2O2组、H2O2+siRNA组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平比较（±s，n=3）Table 2 Comparison of mRNA expression levels of TLR4，MyD88，NFκB in control group，H2O2 group，H2O2+siRNA group

注：a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与H2O2组比较，P＜0.05

组别TLR4 mRNAMyD88 mRNA NF-κB mRNA对照组1.09±0.050.99±0.061.02±0.04 H2O2组2.78±0.17a1.43±0.05a1.36±0.05 H2O2+siRNA组6.10±0.60ab2.52±0.11ab2.23±0.19ab F值49.5332.6426.66 P值＜0.001＜0.001＜0.001

3 讨论

AS是目前比较常见的心血管疾病，能够导致血管内膜结构与功能发生变化，管壁增厚是其主要病理特点［1］。氧化应激是导致AS发生发展的主要因素之一，当内皮细胞受到氧化应激的刺激后，会引起低密度脂蛋白发生氧化，刺激黏附因子表达，导致细胞黏附性增加及细胞聚集，其还会促进NO的释放，造成血管功能障碍［11］。同时，慢性炎症也是造成AS加重的主要原因，研究表明，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在AS的炎症反应中发挥着重要作用，其中MyD88作为TLR4的衔接蛋白，起着关键的信号转导功能，其在接收到TLR4信号后可激活NF-κB［12］。

本研究构建氧化应激细胞模型前，首先探索合适的诱导条件。氧化应激细胞模型的诱导手段有很多，本研究选择H2O2，因为其应用较广泛，作用直接，性质稳定［13］。本研究结果显示，B、C、D组细胞活性均小于A组，且C组细胞活性最接近60%，故H2O2诱导氧化应激细胞模型的最佳干预时间为8 h。

LncRNA MALAT1定位于染色体11q13.1上，首次在非小细胞肺癌中被发现，其可以调控细胞增殖，影响肿瘤的发生［14］。研究显示，抑制LncRNA MALAT1可促进乳腺癌模型小鼠癌细胞迁移［15］。同时，LncRNA MALAT1在氧化应激引发的心血管疾病中也能发挥一定作用。LI等［16］研究发现，心肌梗死患者LncRNA MALAT1表达水平升高，LncRNA MALAT1可能成为预测心肌梗死的标志物。有研究者在高脂饮食诱导的AS模型小鼠中发现，过表达LncRNA MALAT1可以通过ox-LDL来调控Wnt/β环，从而促进AS的发生［17］。本研究结果显示，H2O2组LncRNA MALAT1表达水平低于对照组，与CHEN等［18］研究结果类似，该研究表明，靶向敲除LncRNA MALAT1后小鼠心脏微血管内皮细胞的氧化应激反应更加剧烈。但本研究结果与RADHAKRISHNAN等［19］研究结果不同，可能是所用细胞系及干预方式不同导致的，RADHAKRISHNAN等［19］选择的细胞系为视网膜内皮细胞，且使用高糖诱导氧化应激。

有研究者采用脂多糖诱导小鼠心肌细胞氧化应激，结果显示，心肌细胞中TLR4、MyD88、NF-κB表达水平升高［20］。研究显示，在中枢神经系统中，抑制小胶质细胞TLR4、MyD88、NF-κB的表达，可以减轻氧化应激，进而抑制神经元凋亡［21］。本研究结果显示，H2O2+siRNA组TLR4、MyD88、NF-κB表达水平高于对照组，MyD88、NF-κB表达水平高于H2O2组；H2O2组TLR4、MyD88 mRNA表达水平高于对照组，H2O2+siRNA组TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平高于对照组、H2O2组；提示在氧化应激环境下，LncRNA MALAT1表达水平降低，进而导致TLR4/MyD88/NF-κB信号通路被激活，这与既往研究结果［22］类似。但本研究结果与JIA等［23］研究结果存在差异，可能是采用的细胞和模拟的病理环境不同导致的，JIA等［23］使用人心肌细胞模拟心肌炎，结果显示，下调LncRNA MALAT1可抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活。

综上所述，氧化应激环境下，LncRNA MALAT1表达水平降低，进而导致内皮细胞TLR4/MyD88/NF-κB信号通路被激活，这为预防和治疗AS提供了新的理论依据。但本研究为细胞实验，且未进行动物实验，后期尚需要进行动物实验进一步验证本研究结论。此外，LncRNA MALAT1与多种微小RNA有关，SUN等［24］研究发现，LncRNA MALAT1与miR-503位点结合后可抑制下游JAK2/STAT3信号通路的激活，本研究组后续会对此展开研究。

作者贡献：纪海涛进行文章的撰写、数据分析；赵颖馨、柴强、刘振东进行文章的构思与设计；于锡巧、张丛丛进行文献的收集与整理；赵颖馨进行文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。