连续流动分析法测定坚果中总氰

陈祝军，秦园，吴梅，吴建兵，朱楠，沈怡佳

张家港市疾病预防控制中心（苏州 215600）

随着社会经济的发展、人民生活水平的日益提高，腰果、核桃、开心果、杏仁、碧根果等坚果业已成为人民休闲食品首先[1]。氰化物在自然界中广泛存在，在食品中主要以氰苷形式存在，含有这些有毒物质的食物被食用后，在人体β-葡萄糖苷酶等酶或者胃酸的作用下，可水解成氢氰酸，可以引起慢性、急性中毒，同时伴有蛋白质代谢障碍，容易引起神经系统疾病[2-5]。目前，食品中氰化物的测定方法有银量法[6-7]、比色法[8-9]、极谱法[10-11]、离子色谱法[12-13]、气相色谱法[14-15]、气相色谱-质谱法[16-17]等。GB 5009.36—2016《食品安全国家标准 食品中氰化物的测定》[18]中氰化物的测定采用比色法、气相色谱法，需要对样品进行蒸馏、衍生处理，步骤复杂，消耗化学试剂多，对环境产生污染且耗时耗力。文章参考相关文献[19]，采用0.30 mol/L NaOH溶液、70 ℃超声60 min，取上清液离心后经连续流动注射仪分析，样品不需要预蒸馏，简化了操作步骤，减少了试剂的使用，适合用于大批量样品的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杏仁、腰果、南瓜子、葵花子、巴旦木、核桃（市售），各0.5 kg，分别用粉碎机粉碎成均匀的粉末，经0.125 mm过筛，保存至密封罐中待用。

氰化物标准品（编号BW 20005-50-W-50，质量浓度为50.0 mg/L，坛墨质检科技股份有限公司）；柠檬酸（分析纯，天津市博迪化工有限公司）；氢氧化钠（分析纯，上海山海工学团实验二厂）；邻苯二甲酸氢钾（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；氯胺T、1, 3-二甲基巴比妥酸、异烟酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸二氢钾、磷酸二氢钠（分析纯，江苏永华精细化学有限公司）。

SAN++型连续流动分析仪，配备全自动进样系统，600 nm滤光片（荷兰SKALAR公司）；TU-1901分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；Simplicity® UV型纯水系统（美国Millipore公司）；KQ-300 DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FA 2004电子天平（上海上平仪器有限公司）；MIKRO 22离心机（德国Hettich公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

准确称取0.5 g（精确至0.001 g）样品粉末于250 mL碘量瓶中，加入50 mL 0.30 mol/LNaOH浸提液，加盖密封后，振荡涡旋混匀，经70 ℃超声提取60 min，取出冷却，取浸提液离心后，供测定使用。

1.2.2 工作试剂及仪器参数

1.2.2.1 工作试剂

连续流动分析法：（A）蒸馏试剂，20 g柠檬酸+100 mL 氢氧化钠（0.4 mol/L）+25 mL盐酸（1.0 mol/L），用纯水定容至1.0 L；（B）缓冲试剂：2.3 g NaOH+20.5 g邻苯二甲酸氢钾溶解于1.0 L纯水中；（C）氧化剂：2.0 g氯胺T溶解于1.0 L纯水中；（D）显色剂：16.8 g 1, 3-二甲基巴比妥酸+13.6 g异烟酸+7.0 g NaOH溶解于1.0 L纯水中，并用盐酸（1.0 mol/L）调节pH至5.2。

分光光度法：（A）缓冲试剂：34.0 g磷酸二氢钾+35.5 g磷酸二氢钠溶解于1.0 L纯水中；（B）氧化剂：1.0 g氯胺T溶解于100 mL纯水中；（C）显色剂：1.5 g异烟酸溶于24.0 mL NaOH（20.0 g/L）溶液中+0.25 g吡唑酮溶于20 mLN-二甲基甲酰胺中。

1.2.2.2 仪器参数

连续流动分析仪样品检测波长为600 nm，起始忽略时间为1 000 s，终末忽略时间为120 s，自发时间为1 800 s，蒸馏温度125 ℃，检测温度为37 ℃。

1.2.3 标准溶液配制及标准曲线设置

准确吸取1.0 mL总氰标准溶液于50 mL容量瓶中，用0.03 mol/L NaOH溶液稀释并定容至刻度，配制成1 mg/L总氰标准储备液，待用。标准曲线设置：将100 μg/L总氰标准储备液稀释成质量浓度分别为5.0，10，20，50，80和100 μg/L的工作液进行试验。

1.3 计算公式

样品中总氰的含量按式（1）计算。

式中：W为样品中总氰的含量，mg/kg；C为浸提液中总氰的质量浓度，μg/L；V为浸提液体积，mL；m为样品质量，g；F为稀释倍数。

1.4 数据处理

使用Excel软件，整理、计算试验数据。使用SPSS 18.3软件进行统计学分析，两种检测方法的检测数据采样Wilcoxon秩和检验进行统计分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件优化

2.1.1 浸提液浓度的选择

杏仁中的总氰可由NaOH溶液浸出提取。此次试验考察了不同浓度0.05，0.10，0.15，0.30，0.50 mol/L NaOH溶液对杏仁中总氰的浸提效力。试验结果表明：随着NaOH浓度升高，总氰的浸出含量增高，NaOH溶液浓度为0.30 mol/L时，杏仁中总氰的浸出含量达到最高（见图1），因此选择0.30 mol/L NaOH溶液用于样品浸提。

图1 不同浓度浸提液对总氰的浸提效力

2.1.2 浸提时间的优化

此次试验进一步考察了浸提时间对样品中总氰的浸提效力影响。样品在0.30 mol/L NaOH浸提液中70 ℃超声分别提取30，60和90 min（见图2），结果表明，总氰的浸出含量在60 min时达到峰值，之后趋于稳定，为防止浸提时间过长总氰挥发减少，选择60 min作为超声提取时间。

图2 不同浸提液时间对总氰的浸提效力

2.1.3 浸提温度的优化

此次试验进一步考察了浸提时间对样品中总氰的浸提效力影响。样品在0.30 mol/L NaOH浸提液中分别在30，50，70和90 ℃温度下超声提取60 min（见图3），结果表明，总氰的浸出含量在70 min时达到峰值，之后趋于稳定，为防止浸提时间过长导致总氰受热分解挥发，选择70 ℃作为超声提取温度。

图3 不同浸提液温度对总氰的浸提效力

2.2 检出限和标准曲线

以100 μg/L总氰标准储备液为初始溶液，用0.03 mol/L NaOH溶液稀释成5.0 μg/L总氰工作液，重复测定11次，以其响应值标准偏差的3倍作为仪器检出限为0.5 μg/L，此方法中总氰的检出限为0.05 mg/kg，定量限为0.15 mg/kg（样品量以0.5 g计）。以总氰溶液浓度（x，μg/L）对各浓度对应的信号峰高（y）作线性回归分析，总氰在0～100 μg/L范围内线性关系良好线性方程：y=0.000 6x+0.000 2，线性相关系数（r）为0.999 5。

2.3 加标回收率和精密度

对杏仁样品做2.50，7.50和12.50 mg/kg三个水平总氰添加试验，按1.2.1小节进行样品处理后，经连续流动分析法检测，计算加标回收率，每个浓度水平单独测定6次。试验结果显示：在不同加标水平下，总氰的回收率为92.4%～108.7%，相对标准偏差（SRSD）为1.3%～2.0%，见表1。

表1 连续流动分析法检测杏仁中总氰加标回收率和SRSD结果（n=6）

2.4 方法对比

运用超声提取-连续流动分析法和GB 5009.36—2016《食品安全国家标准 食品中氰化物的测定》[18]第一法分光光度法同时检测6种坚果样品，结果见表2。经Wilcoxon秩和检验统计分析两种方法的检测结果，Z=-0.105，P=0.917＞0.05，显示两种检测方法测定结果差异无统计学意义。

表2 两种方法对不同样品中总氰含量的检测结果单位：mg/kg

3 结论

此次试验对坚果中总氰浸提的前处理条件进行了考察，以0.30 mol/L NaOH溶液、70 ℃超声60 min为优化的前处理方法，有效地提取了坚果中总氰，并通过连续流动分析法进行总氰浓度检测。通过方法学验证，该方法总氰的检出限为0.05 mg/kg，定量限为0.15 mg/kg，加标回收率为92.4%～108.7%，相对标准偏差为1.3%～2.0%（n=6）。在实际样品检测中，超声提取-连续流动分析法测定结果与GB 5009.36—2016《食品安全国家标准 食品中氰化物的测定》[18]第一法分光光度法测定结果相比较，Z=-0.105，P=0.917＞0.05，测定结果差异无统计学意义，说明方法可靠。此次试验所建立的超声提取-连续流动分析法利用电脑软件整合了试剂混合、加热、蒸馏等程序，实现了检测自动化，减少试剂用量，且灵敏度高、精密度、准确度好，可作为大批量食品样品中氰化物的检测方法之一。