三文鱼刺身中菌落总数不确定度评定

宁礼信，周敏，黎子林，苏水娇，高志城，张任广

1. 广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学测量与应急检测技术重点实验室，广东省原位电离质谱分析工程技术研究中心（广州 510070）；2. 中国检验检疫科学研究院粤港澳大湾区研究院（中山 528437）

食品安全是一直以来备受关注的话题[3]，菌落总数又是评价食品卫生状况的一项重要指标[4-5]，因此对食品中菌落总数进行测量不确定度的评价[6-10]非常必要。国际上对各种食品中菌落总数不确定度的测量都有丰富经验，但对生食水产品中菌落总数不确定度的评定研究较少，试验依据GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[1]检测三文鱼刺身样品的菌落总数，按照JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[2]规范分析检测结果不确定度的来源并建立数学模型，分别对引入的不确定度分量进行评定，以合成计算的方法评定菌落总数的不确定度[11-13]，通过有效评定菌落总数测定结果的不确定度，进一步提升实验室检测数据的准确度和可靠性。

1 材料与检测方法

1.1 测试样品

研究测量不确定度评定实例为单一样品的重复测量，测试样品为三文鱼刺身。即食生制动物性水产品的微生物限量应符合GB 10136—2015《食品安全国家标准 动物性水产制品》[14]，该标准采取的是三级采样方案，其菌落总数的限值为n=5，c=2，m=5×104CFU/g，M=105CFU/g，即：在5个样品中，允许全部样品中相应微生物指标检验值≤5×104CFU/g；允许有≤2个样品其相应微生物指标检验值在5×104CFU/g和5×105CFU/g之间；不允许有样品相应微生物指标检验值大于105CFU/g。根据已有检测经验，三文鱼菌落总数的稀释度确定为10-1，10-2和10-3这3个稀释度。

1.2 材料与设备

平板计数琼脂（250 g，北京陆桥技术股份有限公司）；电子天平（T1000Y，常熟市双杰测试仪器厂）；万级洁净实验室；高压蒸汽灭菌器（HVA-110，日本Hirayama公司）；洁净工作台（SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司）；生化培养箱（1400型，新西兰 Contherm Scientific Ltd.）。

1.3 试验方法

1.3.1 检测依据

菌落总数测定根据GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[1]。

1.3.2 检测过程

以无菌操作将25 g检样生食水产品（三文鱼刺身）放于盛有225 mL灭菌生理盐水无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2 min，制成1∶10的均匀稀释液。用1 mL无菌吸管吸取1 mL 的1∶10样品匀液，沿管壁缓慢注入含有9 mL稀释液的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液面），振摇试管，混合均匀，制成1∶100的样品匀液。另取1 mL灭菌吸管，按上述操作方法，制备10倍递增稀释匀液，如此每递增稀释1次，即换用1支1 mL灭菌吸管。根据对样品污染情况的估计，选择3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释的同时，吸取1 mL样品匀液于无菌培养皿内，每个稀释度做2个平皿。同时，分别吸取1 mL空白稀释液加入2个无菌平皿内做空白对照。样品匀液移入培养皿后，应及时将冷却至48 ℃平板计数琼脂培养基注入培养皿15～20 mL，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，置30±1 ℃生化培养箱内培养72±3 h。记录稀释倍数和相应的菌落数量。

1.3.3 菌落计数

选取菌落数在30～300 CFU、无蔓延菌落生长的平板作为菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用2个平板平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平板内上出现菌落间无明显界线链状生长时，则应将每条链作为1个菌落计数。

1.3.4 数学模型

当只有一个稀释度平板上的菌落在计数范围内，按式（1）计算。当有2个连续的稀释度平板上的菌落在计数范围内，则按式（2）计算。

式中：N为检测样品中的菌落总数；∑C为平板菌落总数的和，CFU/g；n1为低稀释倍数平板个数；n2为高稀释倍数平板计数；d为稀释因子（第一稀释度）。

2 测量不确定度评定

菌落总数不确定度测量除各种系统因素的影响外，还包括随机因素的影响[15]。主要对样品制备过程中引入的不确定度及重复测量时引入的不确定度进行分析。

2.1 样品制备过程中引入的不确定度—

2.1.1 天平引入的不确定度

试验所使用的天平最大称量为1 000 g，检定分度值为1 g，实际分度值为0.1 g，根据JJG 1036—2008《中华人民共和国计量检定规程：电子天平》[16]规定，此类天平在0～500 g称量范围时的允许误差为±0.5 g，按矩形分布，，天平称量引入的相对标准不确定度为。

2.1.2 量筒引入的不确定度

试验所使用量筒为250 mL，根据JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》[17]规定250 mL量筒容量允许误差为±2.0 mL，根据CNAS-GL006：2019《化学分析中不确定度的评估指南》[18]，按三角分布处理，即，量筒引入的相对标准不确定度为Urel(量筒)=。

2.1.3 样品稀释过程引入的不确定度

样品稀释时使用1 mL和10 mL这2种移液枪，用1 mL移液枪吸取1 mL的不同稀释度溶液，用9 mL移液枪吸取9mL无菌生理盐水，按照JJG 646—2006《移液器检定规程》[19]，量取1 mL和9 mL液体时，容量允许误差分别是±1.0%和±0.6%，取矩形分布，，移液枪引入的相对标准不确定度为。试验取3个连续稀释度（10-1，10-2和10-3），样品稀释过程中引入的相对标准不确定度为0.012 1。

2.2 重复测量时引入的不确定度

同一样品重复测量10次，取其平均值作为测量结果，见表1。

表1 10次重复测量的平皿计数结果

结果数据发散性大，用常规的直接根据平均值得到标准偏差的方法显得有些不合理。通常的做法是取对数以后再用常规的贝塞尔方法进行计算。

表2 单一样品重复测量的计算过程

2.3 合成标准不确定度和扩展不确定度

2.4 仅考虑重复测量引入的不确定度

平均值的标准不确定度为μc(lgx)=Urel(菌落)=0.134 6。95%置信概率下包含因子k取2，其扩展不确定度为U=k×μc(lgx)=2×0.134 6=0.27。取反对数，由lgx坐标回到x坐标。由于lgx与x之间的非线性关系，不能直接求扩展不确定度U的反对数，只能给出微生物含量的可能区间。因此确定lgx的取值范围lgx=4.16±0.27，或写成3.89≤lgx≤4.43。取反对数后，仍可得7.8×103CFU/g≤x≤2.7×104CFU/g。

2.5 不确定度报告

按照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[1]规定的检测程序进行，被测样品微生物菌落总数（10次测量平均值）在7.8×103～2.7×104CFU/g之间。

3 结论

菌落总数是食品微生物检验的常规项目之一，不同产品有不同的菌落总数限量标准。当结果处于临界值时，取值区间就显得尤为重要[20]。由于菌落总数检测结果的数据发散性较大，不符合正态分布，不适用于直接计算其标准差，因此需取其对数后进行数据的统计分析，利用贝塞尔公式计算标准不确定度，最终合成菌落总数测定的不确定度，以进一步减少各方面引入的误差，使检测结果更加接近真值[21]。从研究结果看，重复测量结果中最大值和最小值相差约4倍，发散较大，与其相比，其他不确定因素都可以忽略，因此仅考虑由测量结果发散引入的不确定度即可。应用不确定度分析和评定能够更加了解动物性水产制品菌落总数测定过程中的误差来源，减少测试人员在试验过程中由于操作不当对检测结果造成的影响，在结果处于超标临界值时发挥一定的判定作用，确保检测数据的准确性、可靠性、科学性和客观性。