竹笋多糖提取工艺优化及抗氧化能力研究

李俊杰 ，杨爱国，张文艳 ，王锐，王磊，亢凯杰*

1. 昭通学院化学化工学院（昭通 657000）；2. 云南省高校高原特色功能食品研究重点实验室（昭通 657000）

竹笋，别名笋、笋子等，大量分布于我国云贵川、广西、江南地区。竹笋具备低脂、低糖和多纤维的生物功能特性，营养丰富，能促消化、防便秘，也是减肥良品。而且竹笋还含有大量人体所必需的氨基酸、维生素和矿物质等[1]。市面上竹笋产品主要是笋干、酸笋和其他制品，其中酸笋最受人们青睐。据统计，广西柳州特色小吃“螺蛳粉”因添加酸笋而使其味道独特走红全国，因此当地竹笋的经济价值上涨，成为致富增收的新途径[2-3]。竹笋除用于鲜食，它活性成分的开发也备受关注。据报道，竹笋多糖对人体过多的氧自由基有很好的清除作用，有延缓衰老的作用[4]。食品行业中，抗氧化能力指数是衡量食品、果汁和添加剂品质的重要标准。周芷冉等[4]对竹笋多糖进行抗氧化研究表明，竹笋多糖在DPPH、羟自由基清除能力等方面均表现出良好的活性。此次研究采用广西柳州麻竹笋为原料，对竹笋多糖进行提取、分离纯化后，对其体外抗氧化能力进行评估，为竹笋资源的拓展和开发功能性新食品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

广西麻竹笋；醋酸铅、苯酚、浓硫酸、葡萄糖、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、冰醋酸、乙醇、邻苯三酚（均为分析纯，天津风船化学试剂有限公司）；福林酚（博林达科技有限公司）；DEAE-52纤维素（北京瑞达恒辉科技发展有限公司）。

1.2 主要仪器与设备

紫外可见分光光度计（UV-2700，日本岛津企业管理有限公司）；旋转蒸发仪（YRE-2000A，巩义市予华仪器有限公司）；层析柱（16 mm×100 cm，瑞达恒辉有限公司）；离心机（Cenlee20R，湖南湘立科学仪器有限公司）；全波长酶标分析仪（PT-3052C，北京普天新桥技术有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 竹笋多糖提取工艺

竹笋→粉碎→水浸提→滤液→浓缩→除蛋白→离心→上清液→竹笋粗多糖溶液→层析→不同组分竹笋多糖溶液

1.3.2 多糖含量的测定

参照文献[5]的试验方法。吸取0～1.0 mL的0.1 mg/mL葡萄糖标准溶液于比色管中，用蒸馏水补充至2.0 mL，加1.0 mL 5%苯酚溶液和5 mL浓H2SO4，摇匀，静置30 min，于490 nm波长处测定吸光度，并绘制标准曲线，样品测定同上。

1.3.3 竹笋多糖提取单因素试验

（1）液料比的影响：称取各100.0 g竹笋匀浆5份（下同），分别按液料比15∶1，20∶1，25∶1，30∶1和35∶1（mL/g）加入蒸馏水；于95 ℃水浴锅中浸提4 h，在4 200 r/min下离心8 min，收集上清液，剩余残渣重复提取1次，合并上清液，浓缩后冷冻干燥，按式（1）计算多糖提取率。

式中：m为多糖质量，g；m1为竹笋质量，g。

（2）提取时间的影响：样品按（1）中最优液料比，置于95 ℃水浴锅中分别浸提2，3，4，5和6 h，后续其他操作同（1）执行。

（3）提取温度的影响：样品按（1）中最优液料比和（2）中最佳时间，分别在80，85，90，95和100℃下提取，后续其他操作同（1）执行。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验基础上，选择液料比、提取时间、提取温度3个自变量，以竹笋多糖提取率为响应值，根据Design-Expert 8.0.6设计试验，由Box-Behnken中心组和试验原理，设计三因素三水平响应面试验分析。

1.3.5 DEAE-52纤维素分离竹笋多糖

参照Shang等[6]的方法，将DEAE-52纤维素装入层析柱中，通入蒸馏水洗脱12 h后加入3 mL 3%的竹笋多糖溶液，分别用0.1，0.2和0.4 mol/L的NaCl溶液进行洗脱，控制速度1 min/mL，每10 min收集1管，按照1.3.3测得吸光度，以横坐标为洗脱管数，纵坐标为吸光度，得曲线。

1.3.6 竹笋多糖体外抗氧化性的研究

参照文献[7]对麻竹笋多糖组分的DPPH和羟自由基清除率进行测定。DPPH清除率采用DPPH-乙醇法，以VC作为对照进行；羟自由基清除率采用Fenton反应体系法，以蒸馏水作为空白对照执行。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对多糖提取率的影响

由图1可知，在液料比15∶1（mL/g）时，竹笋多糖提取率最低，为1.76%，说明竹笋多糖未被充分提取出来，随着液料比的增加，提取率不断升高，多糖充分释放出来，液料比达到30∶1（mL/g）时，提取率达到最高，为2.81%。此时继续提高液料比，多糖提取率有下降趋势，可能因为大量溶剂的加入，使得提取过程中多糖部分流失。张帅等[8]对笋壳多糖进行提取时发现，液料比超过30∶1（mL/g）时，多糖提取率下降明显，可能因为过多的溶剂对样品细胞中某些物质的溶出有促进作用，改变细胞渗透压，不利于多糖的溶出。多糖的提取属于传质过程，虽然传质的驱动力固-液两相可以增加多糖的扩散，扩散达到平衡时，继续增大液相比例并未提高产量时反而会降低效能，造成资源浪费。因此可选择25∶1，30∶1和35∶1（mL/g）的液料比进行后续试验。

图1 液料比对竹笋多糖提取率的影响

2.1.2 提取时间对多糖提取率的影响

由图2可知，竹笋多糖提取率随着时间的增加而升高，5 h时提取率最高，达2.88%。继续延长时间，竹笋多糖提取率不再升高，提取时间达到6 h时，多糖提取率下降明显，为2.60%。此变化趋势与陈蕾俊等[9]研究几乎一致。虽然长时间的提取更有利于多糖从细胞中渗透出来，但多糖的分子结构在长时间高温下有可能被水解。因此选择4，5和6 h进行后续试验。

图2 提取时间对竹笋多糖提取率的影响

2.1.3 提取温度对多糖提取率的影响

由图3可知，提取温度80 ℃时，竹笋多糖提取率最低，为1.74%，可能由于温度过低，不利于多糖的渗出，随着温度的升高，提取率增加，温度达到90℃时达到峰值2.91%，说明高温处理有利于多糖的提取。而继续升高温度，提取率略有下降。高温可以提高多糖的扩散系数和溶解度，从而提高多糖提取率，而且理论上随着温度的升高，多糖提取率会升高，但多糖在长时间高温条件下，其糖链有可能会发生断裂而造成多糖分子量下降而被透析除去，使得提取率下降[9]。因此选择80，85和90 ℃进行后续试验。

图3 提取温度对竹笋多糖提取率的影响

2.2 竹笋多糖的响应面优化结果

2.2.1 响应面试验设计

在单因素试验研究下，选择液料比25∶1，30∶1和35∶1（mL/g），提取时间4，5和6 h和提取温度80，85和90 ℃，设计响应面试验因素水平表，在Design-Expert设计试验下，由Box-Behnken中心组和试验原理，得出表1因素水平试验编码表。

表1 响应面试验因素水平设计表

2.2.2 回归模型分析

通过响应面回归分析，得到竹笋多糖提取率（Y）与液料比、提取时间、提取温度的二次多项回归模型。竹笋多糖的提取率可通过试验数据的多元回归分析，以二阶多项式方程估计预测模型：Y=2.86+0.46A+0.23B+0.28C-0.26AB-0.025AC+0.002 5BC-0.32A2-0.17B2-0.21C2，响应面试验结果如表2所示。

表2 响应面试验设计及结果

2.2.3 显著性分析

由表3可知，模型P值＜0.000 1，表示该模型显著并且具有统计学意义。失拟项P值=0.339＞0.05，表示失拟项差异不显著，说明该模型相对于纯误差并不显著，观测值与预测值得到很好拟合，该多项式模型的准确性和一般可用性足够。各系数的显著贡献值由F值检验的P值决定。有学者研究证明定系数（R2）和调整决定系数（Radj2）评价模型的解释力，如果两者的值越接近1，说明模型足以描述观测值与预测值之间关系。模型相关系数R2=0.973，该系数接近1，而拟合模型的决定系数R2=0.938，Rpred2（预测系数）=0.750，两者之差约0.2，说明该模型拟合度较好。对回归模型系数的显著性结果分析可知，一次项A、B、C和二次项A2、C2系数的显著性都＜0.01，表明差异极显著，3个因子对竹笋多糖提取率影响较为敏感，二次项B2系数接近0.05，差异显著。通过F值可知，该试验的3个影响因子对竹笋多糖提取率的影响大小顺序为液料比＞提取温度＞提取时间。根据响应面建立的模型可预测出竹笋多糖提取率的最佳工艺条件：液料比32.94∶1（mL/g）、提取时间5.23 h、提取温度88.08 ℃，在该模型设计试验的预测下多糖提取率为3.11%。为验证该预测值的可靠性，选择液料比33∶1（mL/g）、提取时间5.2 h、提取温度88 ℃进行3次平行试验，提取率为3.06%，3.08%和3.14%，平均值为3.09%，与预测值接近，表明通过响应面优化方法得出的结论可靠，结果预测良好。

表3 响应面模型方差分析

2.2.4 各因素之间的交互作用

理论上响应曲面图的抛物面开口向下，说明响应结果具有极大值点；响应曲面图的陡缓程度可反映因素两两交互效应的强弱，曲面越陡表示两因素交互作用显著，反之则不显著。由图4可知，液料比对响应值的影响比提取时间和提取温度较为显著，而提取温度对响应值的影响比提取时间较为显著，说明各因素之间的具有一定的交互作用，对竹笋多糖提取率有一定影响。3个因素中固定任意1个为零水平，改变其余因素时，随着其水平的提高，多糖提取率均呈先上升后下降趋势。液料比和提取时间的曲面图较陡峭，说明两者交互作用显著，而液料比、提取时间与提取温度的交互作用不显著。该结果与方差分析结果基本一致。

图4 各因素交互作用对提取率影响的响应面图

2.3 分离纯化结果分析

由图5可知，将竹笋粗多糖用DEAE-52纤维素分离纯化，经不同浓度NaCl溶液洗脱竹笋粗多糖溶液，得到3个组分。经0.1 mol/mL NaCl洗脱得到的组分W1，位于第10～第25号试管，0.2 mol/mL NaCl溶液洗脱得到第2、第3组分W2、W3，分别位于第41～第56号和第63～第71号，0.4 mol/mL的NaCl溶液洗脱没有峰，说明多糖溶液已全部分离出来，计算出得率分别为29.53%，45.24%和9.62%。

图5 竹笋粗多糖的分离纯化

2.4 抗氧化性测定结果分析

由图6可知，随着竹笋多糖溶液浓度不断增加，各组分对羟自由基和DPPH的清除率也随着增加，但W2组分的竹笋多糖溶液对羟自由基抑制率明显高于W1、W3组分，其清除率大小为W2＞W1＞W3。W3组分的竹笋多糖溶液对DPPH清除率明显高于其他组分，清除率大小为W3＞W2＞W1。各组分对羟自由基的清除率明显优于对DPPH的清除率，且W1、W2、W3对羟自由基的清除率的IC50（半数抑制浓度）分别为0.49，0.64和0.73 mg/mL。根据Fenton反应原理推测，竹笋多糖有很强的螯合金属离子或惰化金属离子的能力，能有效清除羟自由基，这一理论已基本被证实。周芷冉等[4]证实了竹笋多糖对羟自由基的清除率可达80%。张帅等[8]对竹笋壳多糖组分进行抗氧化研究，结果表明多糖组分浓度1.0 mg/mL时，其对羟自由基清除率可达87.70%，说明竹笋壳多糖抗氧化效果明显。由此可知W1、W2、W3多糖组分对羟自由基和DPPH的清除效果有一定合理性。

图6 各竹笋多糖组分的抗氧化能力研究

3 结论

采用响应面法优化热水浸提竹笋多糖的工艺参数，用DEAE-52纤维素层析柱对竹笋粗多糖进行分离得到3组不同组分，并对其进行体外抗氧化能力研究。通过单因素试验和响应面试验优化得到竹笋多糖提取工艺条件，即液料比33∶1（mL/g）、提取时间5.2 h、提取温度88 ℃，在该条件下竹笋多糖提取率为3.09%，各因素之间对竹笋多糖提取率有一定影响，而液料比和提取时间两因素之间交互作用较显著，影响较大。竹笋多糖分离纯化后得到3个组分W1、W2、W3，各组分对羟自由基、DPPH清除率均有一定清除作用，其中：W1组分对羟基自由基、DPPH的清除率分别为80.24%和18.44%；W2的清除率分别为94.01%和36.42%；W3的清除率分别为78.45%和43.17%。试验通过对竹笋多糖的提取、分离及抗氧化的研究为竹笋资源开发出功能性食品提供一定理论依据。