猪肉源金黄色葡萄球菌生物膜能力与MLST 分型检测

韩国全，吴任之，张 翼，饶均钥，曹芸榕，杨茂杰

（四川农业大学食品学院 食品加工与安全研究所 四川雅安 625014）

金黄色葡萄球菌（S.aureus）生物膜（Biofilm）是一种微生物群落，嵌在由聚合物组成的自生细胞外间质中，使微生物逃避先天免疫系统的作用，与浮游的活跃生长培养物相比，生物膜中的细胞耐药性更强，导致伤口愈合时间延长或形成不可愈合创口[1]。针对金黄色葡萄球菌生物膜的检测方法有很多，包括刚果红法、96 孔微量板定量检测法、激光共聚焦扫描显微镜等。生物膜基因（bap、icaA、icaD）、黏附相关基因（fnbA、fnbB、clfA、clfB、can）等均是导致其成膜的重要因素，其中合成细胞间黏附多糖的icaA、D、B、C操纵子的表达至关重要。Bazari 等[2]研究证明，金黄色葡萄球菌胞外多糖层与生物膜的形成有一定关系，分离株中icaA、D基因的存在与体外生物膜的形成无关。clfA、clfB是导致金黄色葡萄球菌黏附的主要因素之一。目前针对牛乳或者牛乳腺炎中该基因的研究较多，而针对生鲜猪肉的研究极少。Ren 等[3]发现奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌分离株的clfA、clfB基因的检出率为100%。

在探索金黄色葡萄球菌生物膜形成能力同时，也需要进行多位点序列分型分析（MLST），该分型结果可在不同实验室、地区甚至国家之间进行对比，进行全球性的流行病学调查研究。截至2021 年12 月，金黄色葡萄球菌数据库中包含7 330 种ST 型，不同金黄色葡萄球菌管家基因片段因不同的等位基因而有不同序列，扩增管家基因后测序，与MLST 数据库（http：//www.mlst.net）中的序列进行比较，即可获得等位基因谱和相应的ST 型。王琦等[4]总结了亚洲、北美洲、欧洲金黄色葡萄球菌的ST 起源及流行现状，ST59、ST72、ST772 是起源于亚洲的金黄色葡萄球菌分型，ST5/USA100、ST1/USA400、ST8/USA300 是北美洲主要的ST 型，医院获得克隆ST22/EMRSA-15 和动物中流行的ST398 都首先出现于欧洲。随着时代和社会的发展，这些ST 型也在不同地区、宿主中交叉传播。

鉴于金黄色葡萄球菌的生物膜及不同ST 型对其耐药性、致病性等方面的较大影响，本研究对前期从雅安市生鲜猪肉中分离的金黄色葡萄球菌进行生物膜的形成和MLST 分型检测，分析分离株的成膜机制及遗传多样性，同时完善金黄色葡萄球菌的MLST 数据库。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

试验用73 株金黄色葡萄球菌为本团队前期从雅安市生鲜猪肉中分离所得，夏季37 株，冬季36 株[5]；标准菌株：金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC 25923），表皮葡萄球菌标准菌株（ATCC 12228），由四川农业大学食品学院微生物团队保存。

1.2 主要试剂与仪器

刚果红琼脂：BHI 肉汤37 g/L，蔗糖36 g/L，刚果红0.8 g/L，琼脂10 g/L，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min；Baird-Parker 琼脂平板、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、脑心浸出液肉汤（BHI）；聚合酶链式反应用2×Taq Master Mix、DL2000 DNA Marker、引物（成都擎科生物技术有限公司）。

LMQ.C-100E 自动高压灭菌器，山东新华医疗器械股份有限公司；T100 型PCR 仪、SUBCELLGT 水平电泳槽、GELDOCXR 凝胶成像分析仪，美国Bio-Rad 公司；S4800 场发射扫描电镜，日本日立公司；Varioskan LUX 酶标仪，赛默飞世尔科技公司；麦氏比浊仪，法国梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 刚果红琼脂试验 挑取单菌落接种于TSB培养基，37 ℃，180 r/min 培养过夜，将培养好的细菌划线于刚果红琼脂平板，37 ℃培养18 h，置于室温72 h 后观察菌落特点。产生物膜的菌落为黑色，不产生物膜的菌落为红色，试验重复3 次[6-7]。

1.3.2 96 孔微量板定量检测试验 通过酶标仪测量菌株在96 微孔板中生长后的吸光度值，进行金黄色葡萄球菌生物膜形成定量研究。具体操作参照Wang 等[8]和张阳[9]的方法：挑取单菌落接种于TSB 培养基中，37 ℃过夜培养，将菌液稀释至0.5 麦氏浊度，备用。将200 μL 含1%葡萄糖的新鲜TSB（TSBglc）培养基分别加入96 微孔板中，再取上述菌液按1%的接种量加入96 微孔板中。金黄色葡萄菌株ATCC 25923 作为阳性对照，表皮葡萄球菌标准菌株ATCC 12228 作为阴性对照，TSBglc培养基作为试剂空白。37 ℃培养72 h 后弃去菌液，用200 μL PBS 洗涤3 次，200 μL 甲醇固定20 min 后弃去，自然干燥，用200 μL 0.4%结晶紫染色15 min，再用无菌PBS 洗涤3 次，自然风干，最后用200 μL 33%冰醋酸溶解30 min，酶标仪测定波长570 nm 处的光密度值，OD 值反映生物膜与接触表面黏附的牢固程度，试验重复3 次。

依据临界ODc 值（ODc 等于空白孔的平均值加上其3 倍标准差）对生物膜分类[8-9]：OD≤ODc为 不黏附，ODc ＜OD ≤2ODc 为弱黏附，2ODc ＜OD≤4ODc 为中等黏附，OD＞4ODc 为强黏附。

1.3.3 生物膜扫描电镜观察 锈钢片的清洗：丙酮浸泡不锈钢片（1.0 cm×1.0 cm）除去表面油脂，然后把不锈钢片放在5 mol/L 盐酸溶液中浸泡15 min，用洗涤剂清洗，再用蒸馏水冲洗干净。最后把不锈钢片放入18 mm×180 mm 试管中，加入10 mL TSB 培养基，灭菌[10]。

接种培养：将不同黏附能力的菌株在TSB 培养基中37 ℃，180 r/min 培养6～8 h，按1%的接种量接入上述试管中，37 ℃培养48 h。

样品制备：不锈钢片用PBS 溶液冲洗2 次，去除浮游菌，用2.5%戊二醛溶液固定至少2 h 后，用PBS 冲洗2 次，依次用30%，50%，70%，99%的乙醇脱水15 min，经醋酸乙戊酯置换、临界点干燥仪干燥、喷金，经过扫描电镜观察生物膜微观形态，观察其是否能够在不锈钢片上形成不同密度的生物膜，试验重复3 次。

1.3.4 生物膜基因检测 PCR 技术检测金黄色葡萄球菌的成膜基因和黏附基因，分析被膜基因与表型之间的相关性。成膜基因包括：bap、icaA、icaD，黏附基因包括：fnbA、fnbB、clfA、clfB、can[8]。PCR 反应体系为PrieSTAR mix 12.5 μL，模板2 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 补足25 μL。PCR扩增条件见表5。将反应好的PCR 产物吸取5 μL 进行琼脂糖凝胶电泳检测（121 V，30 min）后，观察目的条带。

1.3.5 MLST 分型 根据MLST 数据库（https：//pubmlst.org/organisms/staphylococcus-aureus/primers）提供的7 对管家基因（arcC，aroE，glpF，gmk，pta，tpi和yqiL）的引物序列及条件进行PCR 扩增，将反应好的PCR 产物送至有康生物科技有限公司进行双向测序。将返回的测序结果使用DNASTAR软件进行拼接后，上传至金黄色葡萄球菌多位点分型数据库，以检索出等位基因谱和相应的ST型。若上传的数据无法检索出部分等位基因型或检索出全部等位基因型，而无相应的ST 型，则需在该网站中上传序列和等位基因谱。

表1 PCR 扩增引物序列及退火温度Table 1 PCR primer sequence and annealing temperature

1.3.6 MLST 分组和聚类分析 使用PHYLOViZ v2.0a 软件，基于goeBURST 算法将分离株的ST型分为不同的BGs（BURST group），达到分组和聚类的作用。

1.3.7 分离株遗传进化分析 使用MEGA11 软件将本研究得到的ST 型与国内3 种医源性ST 型（ST6754 食物中毒分离、ST4957 皮肤感染伤口拭子、ST7064 菌血症）、3 种动物源型ST 型（ST7181奶牛乳腺炎、ST6556 健康猪、ST6267 牦牛）和3 种食源性ST 型（ST6650 鸡肉、ST5715 猪肉、ST5731凉面）结合分析，以研究分离株的遗传特性。

1.3.8 数据统计方法 使用Excel、SPSS 软件进行数据整理与分析，PHYLOViZ v2.0a 软件进行聚类分析，MEGA11 软件进行遗传进化分析。

2 结果与分析

2.1 刚果红定性结果

刚果红琼脂试验中，84.93%（62/73）的菌株为生物膜阳性菌株，夏季和冬季分离株的差异不大，2 株冷藏样品分离株均为生物膜阳性，15.07%（11/73）的菌株为生物膜阴性菌株，夏季分离株的阴性检出率明显高于冬季（表2）。

表2 刚果红琼脂试验结果Table 2 Congo red test results

2.2 96 孔微量板定量检测

对73 株菌进行96 孔微量板定量检测，形成强黏附菌株最多，占61.64%（45/73），中黏附菌株占20.55%（15/73），弱黏附菌株占12.33%（9/73），不黏附即不形成生物膜的菌株最少，占5.48%（4/73）。夏季、冬季和常温样品菌株的强黏附能力菌株数均最多，不黏附的菌株最少。2 株冷藏样品分离株中，1 株为不黏附，1 株为中黏附（表3）。

表3 96 孔微量板定量检测结果Table 3 Quantitative detection results of 96-well microplate

2.3 生物膜扫描电镜结果

利用扫描电镜更为直观的确定上述方法中的菌株是否能在钢板糙面上黏附，形成不同密度的菌体细胞。黏附能力强的菌株能在钢板上形成致密的细胞（图1a），中等成膜能力的菌株在钢板上数量中等（图1b），形成弱生物膜的菌在钢板上数量最少，分布稀疏（图1c），图1d 为空白对照。

图1 扫描电镜下金黄色葡萄球菌的形态Fig.1 Morphology of S.aureus under scanning electron microscope

2.4 生物膜基因检测结果

73 株菌均携带生物膜基因，fnbA、clfB检出率最高，为100%。成膜基因icaA、icaD和bap的检出率分别为30.14%，93.15%和0。黏附基因fnbB、clfA、cna、检出率分别为95.89%，86.30%，46.58%。夏季检出率较高的基因为fnbA、clfB、fnbB、icaD、clfA。冬季菌株中，fnbA、fnbB、clfB、icaD检出率最高（表4）。

表4 金黄色葡萄球菌生物膜基因检出情况Table 4 Detection of biofilm genes of S.aureus

多重生物膜基因结果显示，12.33%菌检出4种生物膜基因，38.36%的菌检出5 种生物膜基因，34.25%的菌检出6 种生物膜基因，15.07%的菌检出7 种生物膜基因（表5）。

表5 金黄色葡萄球菌多重生物膜基因携带情况Table 5 Carrying status of multiple biofilm genes of S.aureus

2.5 金黄色葡萄球菌MLST 分型情况

73 株金黄色葡萄球菌有11 株未能分型，占15.07%，夏季6 株，冬季5 株，其余分离株分为26个ST 型，其中7 个ST 型是本研究首次发现并上传至数据库，分别是：ST6770、ST6771、ST6772、ST6775、ST6781、ST6782、ST6990。

在已分型的菌株中，ST188（16.13%，10/62），ST88（14.52%，9/62），ST15（12.90%，8/62），ST398（9.68%，6/62）4 种ST 型的检出率相对较高。26 个ST 型中有31 株菌无克隆群（50.79%），其余菌株分为6 个克隆群，CC1（24.19%，15/62）、CC15（16.13%，10/62）、CC5（6.45%，4/62）、CC8（1.61%，1/62）、CC22（1.61%，1/62）（表6）。

表6 73 株金黄色葡萄球菌MSLT 分型分析Table 6 MSLT typing analysis of 73 strains of S.aureus

2.5.1 不同季节分离株MLST 分型情况 不同季节生鲜猪肉中金黄色葡萄球菌MLST 分型情况见表7，夏季37 株分离株共有20 种ST 型，优势ST型有5 种：ST1、ST88、ST398、ST188 和ST25。冬季36 株分离株共有12 种ST 型，优势ST 型有5 种：ST188、ST15、ST88、ST6、ST398。两个季节的优势ST 型数量一致，冬季优势ST 型涵盖的菌株数量明显多于夏季，而夏季分离株的ST 型明显多于冬季。值得注意的是ST398、ST88、ST188 在两个季节中均为优势ST 型。

表7 不同季节分离株MLST 分型情况Table 7 Types of MLST isolates in different seasons

7 个新的ST 中，ST6770、ST6771、ST6781、ST6772、ST6990 在夏季分离株中被检出，ST6782、ST6775 在冬季分离株中被检出。

2.5.2 不同季节分离株克隆群分析 对金黄色葡萄球菌进行MLST 分型后，可得到分离株的克隆群，食品中最常见的克隆群包括CC5，所含菌株有较强的致病性。本研究中，夏季共计5 种克隆群，CC1 和CC5 是优势克隆群；冬季共计3 种克隆群，CC15、CC1 所含菌株数较CC5 多。

2.6 基于goeBURST 算法的进化分析

对73 株分离株的26 个ST 进行分组和聚类，在SLV＝1 的条件下，分为5 个BGs（BG1、BG2、BG3、BG4、BG5）和8 个单体，5 个BGs 共含有42株菌。BG3 以ST2139 首要奠基者（Primary founder），包括5 种ST 型，17 株菌，其中7 株夏季分离株，10 株冬季分离株；BG4 以ST15 首要奠基者，包括4 种ST 型，11 株菌，其中夏季分离株仅占1 株，冬季分离株有10 株，4 个ST 型可能由ST15 演化而来；BG5 以ST398 首要奠基者，包括3种ST 型，8 株菌，夏季分离株占6 株，冬季分离株占2 株；BG1 和BG2 分别以ST5730 和ST59 为奠基者，均包括3 种ST 型和3 株夏季分离株。

总体上，BG1 和BG2 全部为夏季分离株，BG3两个季节分离株差异不大，BG4 以冬季分离株为主，BG5 以夏季分离株为主（图2）。

图2 不同季节分离株MLST 分型情况Fig.2 Types of MLST isolates in different seasons

2.7 分离株遗传进化分析

如图3 所示，结果显示，分离株与参考ST 型的相关性很强，ST6 为代表的3 株菌与浙江省凉面分离株的亲缘关系最近，ST88 为代表的9 株菌与上海市医院从女性皮肤感染伤口拭子分离株的亲缘性最近，ST9 为代表的1 株菌与河南省猪肉中的分离株亲缘关系最近，而二者的克隆群不同，湖北省健康猪中的ST 型与本研究中的ST6990 亲缘关系最近，推测猪肉中该ST 型的分离株可能直接来自生猪本身。值得注意的是，ST59 为代表的2株菌与北京食物中毒分离株的ST 型亲缘最近，表明这两株菌有导致食物中毒的风险，四川牦牛、奶牛乳腺炎中的ST 型也与部分菌株有一定的相关性。有研究表明，ST5 是我国医院环境中分离率最高ST 型之一[11]，本研究中ST5 与ST188 亲缘关系最近，推测ST188 可能来源于医院环境，ST5 与ST188 共分离得到11 株菌，这些分离株可能与医院环境有关。

图3 分离株遗传进化分析Fig.3 Genetic evolution analysis of isolates

表8 不同季节分离株克隆群分析Table 8 Clonotype analysis of isolates in different seasons

3 讨论

刚果红琼脂法测定金黄色葡萄球菌生物膜形成能力的准确性，在国内外部分研究中有一定争议，Knobloch 等[12]、郭慧琴等[6]、钱卫东等[13]的研究表明，刚果红琼脂法与96 孔微量板法、平板培养法测定结果的相关性不强；而闫兵等[14]研究证明，二者得到的结果基本一致。因此，本研究中，利用刚果红琼脂法、96 孔微量板法与扫描电镜相结合，从定性、定量到验证的流程进行测定。刚果红琼脂法试验中阳性成膜菌株占84.93%，与Demir等[1]从慢性创面感染中分离的金黄色葡萄球菌的阳性率较为一致（86.61%），而高于陈程等[15]从牛乳中分离的金黄色葡萄球菌的黏附率（72%），低于张鹏飞等[16]的黏附率（95.45%），可能与菌株来源以及试验误差有一定关系。96 孔微量板定量检测法中，强、中、弱成膜能力的菌株占比为94.52%，与刚果红法在数据上有一定差异，这与刚果红法结果的低重现性和96 孔微量板法洗板力度有较大关系。通过扫描电镜观察发现，不同黏附能力的菌株确实在钢板上形成了不同程度的聚集，因此前两种方法在一定程度上能够起到对菌株的前期筛选作用，而笔者认为在用专业的洗板机冲洗96孔板的条件下，96 孔微量板法更准确。此外，培养温度、时间、状态、培养基组成等均是影响其成膜率的重要因素。Thiran 等[17]将不同菌株接种在聚苯乙烯组织培养板上，不同温度（37，20 ℃）培养不同时间（24，48，72 h）发现，37 ℃培养24 h 后，54%的菌株无法产生被膜，20 ℃培养48 h 和72 h 后均有70.80%的菌株无法产生被膜，同时该研究还表明，在动态培养条件下更有利于被膜的形成；Lade 等[18]发现添加1.0%葡萄糖的TSB 更利于金黄色葡萄球菌生物膜形成的生长和试验结果的重现，而添加氯化钠的培养基导致生物膜形成的测量结果有很大差异。

在成膜基因和黏附基因PCR 试验中，成膜基因icaA、icaD和bap的检出率分别为30.14%，93.15%和0，其中，bap基因的检出率与Chen 等[19]和马伊萨兰等[20]的研究结果一致，而icaA、icaD的检出率低于Demir 等[1]从创面分离得到的菌株检出率，这可能是创面分离株的致病性更强导致相应基因的检出率较高。Pereyra 等[21]研究证明，icaA、icaD的高检出率与生物膜的形成有必然关系。在本研究中，icaA的检出率低，有5.48%（4/73）的菌株在刚果红琼脂平板和96 孔板培养中均为生物膜阳性，而icaA和icaD基因未检出，一种原因是依赖于icaB和icaC形成被膜，另一种原因是ica非依赖性生物膜的调控系统所致，涉及双组分系统（Tcs）和转录及转录后调节因子，包括RNA分子[22]，同时其黏附基因也是一个重要因素。纤维连接蛋白结合蛋白基因fnbA和fnbB的检出率为100%和95.89%，主要介导金黄色葡萄球菌与纤维蛋白原、弹性蛋白和纤维连接蛋白的黏附；针对生鲜猪肉中clfA、clfB基因的研究极少，在本研究中其检出率为86.30%和100%。

在MLST 分型试验中，ST188、ST88、ST15、ST398 的检出率最高，26 个ST 型分为5 个BGs，BG1 和BG2 全部为夏季分离株，然而由于二者涵盖的菌株数较少，因此代表性并不强；BG4 和BG5涵盖的菌株较多，至于BG4 以冬季分离株为主，BG5 以夏季分离株为主的原因有待进一步探究。在系统发育树分析中，部分分离株与食源性、医源性、动物源性的分离株的相关性很大，存在即食食品中分离株与猪肉交叉污染，致病性强的菌血症分离株，以及食物中毒菌株与猪肉交叉污染，生鲜猪肉中的分离株有直接来自生猪的可能。研究表明，金黄色葡萄球菌通过水平基因转移方式获得耐药、定植和感染相关因子，可能是某一克隆株能成功流行的重要原因，细菌遗传背景、外部条件等都会影响克隆群流行传播[23-24]。同时，本研究中少部分ST 型与参考ST 型亲缘关系较远，原因可能与笔者选择的参考ST 型有关，或二者的亲缘关系本身就较远。