南美白对虾微冻贮藏期间蛋白质品质变化及预测模型的建立

孙康婷，陈胜军，潘 创，胡 晓，邓建朝，李春生

（1 广东海洋大学食品科技学院 广东湛江 524088 2 中国水产科学研究院南海水产研究所 农业农村部水产品加工重点实验室国家水产品加工技术研发中心 广州 510300 3 三亚热带水产研究院 海南省深远海渔业资源高效利用与加工重点实验室 海南三亚 572000 4 大连工业大学 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 辽宁大连 116034）

南美白对虾（Litopenaeus vannamei）是世界上养殖最广泛的甲壳类动物之一。最早捕获于太平洋，目前作为经济上重要的甲壳类资源，在亚洲和南美洲国家进行商业养殖[1]。南美白对虾营养丰富，蛋白含量高，在运输和流通过程中品质极易劣变，蛋白质发生不同程度的氧化、降解和变性。随着居民生活水平的提高，水产品的安全和营养备受关注。如何在流通过程中行之有效地维持水产品品质较为关键。温度控制是流通过程中的一个关键控制点，低温储藏常被用于提高水产品的货架期[2]。目前低温保鲜技术根据温度的不同分为冷藏、冰温、微冻和冻藏[3]。近年来的研究表明微冻能显著延长水产品的保鲜期，约比冷藏保鲜延长1.5～4 倍，尤其对耐冻性较差的水产品的保鲜效果更为显著[4-5]。Ge 等[4]采用-5 ℃微冻结合明胶包埋哈氏仿对虾（Parapenaeopsis hardwickii），研究发现，该保藏方法可有效抑制Ca2＋-ATPase 活力，降低pH、TVB-N 和TBA 值，使保藏期限达到23 d。刘欢等[6]发现，与冰藏（0 ℃）相比，微冻（-2 ℃）可较好地保持大鲵（Andrias davidianus）的肌肉品质。

目前，品质监测预测模型在水产品质量安全方面应用较为广泛[7]，如阿伦尼乌斯（Arrhenius）模型是这些产品最常用的方法，同时，径向基函数神经网络（Radial basis function neural network，RBFNN）模型也在水产品质量监测中得到广泛应用。Xu 等[8]研究发现RBFNN 模型是预测-28～-12℃冻藏大管鞭虾（Solenocera melantho）整个贮藏期品质变化的有效工具，且RBFNN 模型优于Arrhenius 模型。Liu 等[9]研究虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）鱼片在9，6，3，0，-3 ℃贮藏过程中的菌落总数，电导率（EC）、K值、感官评价的变化，并建立前馈人工神经网络（ANN），相对误差均低于10%，可以作为虹鳟鱼质量变化建模的潜在工具。然而，目前鲜有微冻贮藏条件下南美白对虾肌肉蛋白质品质变化和应用RBFNN 预测品质变化的模型报道。本文以南美白对虾为研究对象，比较微冻（-3℃）贮藏条件下表面疏水性、Ca2+-ATPase、总巯基含量、羰基含量、TCA 溶解肽、肌原纤维小片化指数（Myofibril fragmentation index，MFI）、化学作用力（离子键、氢键、疏水相互作用力、二硫键）的变化，同时通过荧光分光光度计、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白变化，用已有的蛋白质变化数据建立RBFNN 品质预测模型，旨在为南美白对虾蛋白质品质的预测提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

活体南美白对虾，广东省广州市华润万家超市，平均体质量为（13.0±0.1）g/尾。

微量总巯基测试盒、超微量Ca2+ATPase 测试盒、羰基含量测试盒，南京建成生物工程研究所；NuPAGETMBis-Tris 预制胶（12%）、NuPAGETMMOPS SDS 电泳缓冲液（20×），英潍捷基（上海）贸易有限公司；BeyoColorTM彩色预染蛋白、5X SDSPAGE 上样缓冲液、考马斯亮蓝染色液，上海碧云天生物技术有限公司；其它试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

T50 型均质机，德国IKA 公司；Sigma-K30 台式高速冷冻离心机，德国Sigma 公司；Sunrize 吸光酶标仪，瑞士Tacan 公司；Cary Eclipse 荧光分光光 度计，美国VARIAN 公司；Mini Gel Tank PAGE 电泳系统，美国赛默飞科技公司；Image Scanner Ⅲ扫描仪，美国EPSON 公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理 用碎冰使虾猝死，流水清洗后去除头部，吸干表面水分，将去头虾随机分成7组，自封袋密封，置于-3 ℃冰箱中冷藏。分别在0，5，10，15，20，25，30 d 取出样品，解冻后测定以下各项指标。

1.3.2 肌原纤维蛋白的提取和测定 参照孟粉等[7]的方法，提取肌原纤维蛋白。肌原纤维蛋白的含量用Bradford 法测定。

1.3.3 肌原纤维表面疏水性的测定 参照Chelh等[10]的方法，测定肌原纤维表面疏水性。

1.3.4 肌原纤维蛋白总巯基、羰基和Ca2+ATPase的测定 按照微量总巯基试剂盒、羰基试剂盒和Ca2+ATPase 试剂盒说明书进行测定。

1.3.5 TCA 溶解肽的测定 参照张喜才[11]和齐慧林[12]的方法，测定TCA 溶解肽。准确称取3 g 搅碎后的虾肉，加入9 倍体积的5%三氯乙酸，冰浴（0℃）条件下充分匀浆1 min，冰浴放置1 h，在4 ℃，5 000×g 离心5 min，取上清液1 mL 加入5 mL 混合液（A 液∶B 液按照体积比50∶1 混合，现用现配。A 液：10 g NaCO3，2 g NaOH，0.5 g 酒石酸钾钠定容至500 mL；B 液：0.5 g CuSO4·5H2O 定容至500 mL），反应10 min，再加入0.5 mL 的福林酚反应30 min，在波长680 nm 下测OD 值。同时配制30，60，90，120，150 μg/mL 质量浓度的酪氨酸标准溶液，绘制波长680 nm 下酪氨酸的标准曲线。样品所测的OD 值代入标准曲线可得到酪氨酸的含量，结果表示为每克肌肉中含有的酪氨酸的量（μmol 酪氨酸/g 肌肉）。

1.3.6 MFI 的测定 参照孙红霞等[13]的方法，稍作修改。准确称取1 g 搅碎后的虾肉，加入15 倍体积预冷的MFI 缓冲液（100 mmol/L KCl，11.2 mmol/L K2HPO4，8.8 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgCl2），冰浴（0 ℃）条件下充分匀浆1 min，过200 目筛，在2 ℃，1 000×g 离心15 min 后弃上清，于沉淀中加入15 倍体积的MFI 缓冲液，沉淀充分悬浮后相同条件下离心弃上清。沉淀用2.5 mL 预冷的MFI 缓冲液充分悬浮后，得肌原纤维蛋白悬浮液，调节蛋白质质量浓度至0.5 mg/mL，在波长562 nm 处用酶标仪测定吸光度，将所得结果乘以200 即可得到MFI 值。

1.3.7 分子作用力的测定 参考Sun 等[14]的方法，稍作修改。取2 g 样品分别与10 mL 的SA（0.05 mol/L NaCl）、SB（0.6 mol/L NaCl）、SC（0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L 尿素）、SD（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L 尿素）和SE（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L 尿素+1.5 mol/L β-巯基乙醇）混合，在2 500 r/min 匀浆5 min 后，于4 ℃静置1 h，8 000 r/min 离心10 min。用Bradford 法测定蛋白质的含量，确定离子键（SB 和SA 中溶解的蛋白质含量之差）、氢键（SC和SB 中溶解的蛋白质含量之差）、疏水相互作用力（SD 和SC 中溶解的蛋白质含量之差）、二硫键（SE 和SD 中溶解的蛋白质含量之差）含量。

1.3.8 内源荧光强度的测定 参照石径[15]的方法，稍作修改。用Tris-maleate 缓冲溶液（0.6 mol/L KCl-0.02 mol/L Tris-maleate，pH 7.0）将肌原纤维蛋白溶液质量浓度调整至1 mg/mL，在激发波长295 nm，发射波长310～400 nm 扫描范围，1 200 nm/min 扫描速度，5 nm 激发和发射狭缝宽度的条件下测定内源荧光强度图谱。

1.3.9 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）参照Pan 等[16]的方法，将肌原纤维蛋白溶液与上样缓冲液（5×）按照3∶1（V/V）比例混合后，沸水加热5 min。用12%的预制凝胶在Mini Gel Tank PAGE 系统进行SDS-PAGE 分析。上样量统一为10 μg，加入胶孔中，以100 V 的恒压电泳70 min。电泳结束后取下凝胶，考马斯亮蓝试剂盒进行染色和脱色，使用Image Scanner Ⅲ扫描仪扫描电泳条带。条带的分子质量通过与蛋白分子质量Marker（6.5～270 ku）进行比较确定。

1.3.10 径向基函数神经网络（RBFNN）预测模型的建立 RBFNN 是一种线性良好的前向网络，具有最佳逼近、训练简洁、学习收敛速度快以及克服局部最小值问题的性能。RBF 神经网络由输入层、隐藏层、输出层构成。RBFNN 预测模型采用SPSS Statistics 19 构建[17]，选择贮藏时间为因子，蛋白质品质特性指标为因变量，其余参数为系统默认值进行分析。

1.3.11 径向基函数神经网络（RBFNN）预测模型的验证 采用模型预测值与试验值进行比较，以验证预测模型的准确性。采用均方误差（Mean squared error，MSE），决定系数（R-Square，R2），相对误差（%）来评估模型的预测精度。

1.4 数据分析

每组试验重复3 次，使用SPSS Statistics 19对数据进行单因素方差分析和差异显著性（P＜0.05）分析，并建立径向基函数神经网络模型，采用Origin 2021 作图。

2 结果与分析

2.1 贮藏期间南美白对虾表面疏水性、Ca2+-ATPase 的变化

蛋白质表面疏水性、Ca2＋-ATPase 是衡量蛋白质变性程度的有效指标，蛋白质变性时表面疏水性上升，Ca2＋-ATPase 活性下降[18]。肌原纤维蛋白表面疏水性可根据其与溴酚蓝的结合能力来确定[19]。由图1 可知，与新鲜的虾相比，随着贮藏时间的延长表面疏水性显著增加（P＜0.05），溴酚蓝结合量从43.13 μg 上升至68.12 μg，在30 d 内上升了58%。这可能是由于蛋白质之间的亚甲基的形成导致蛋白质构象的变化，进而导致疏水氨基酸基团如脂肪族和芳香族氨基酸的暴露[20]。

图1 微冻过程中南美白对虾表面疏水性、Ca2+-ATPase 的变化Fig.1 Changes in surface hydrophobicity，Ca2＋-ATPase of L.vannamei during partial freezing

同时由图1 可知，随着贮藏时间的延长，Ca2＋-ATPase 活性显著下降（P＜0.05），从0.33 U/mg pro下降到0.13 U/mg prot，在30 d 内下降率达到了60.6%，且贮藏前期下降较慢，在15 d 后下降速率比贮藏前期快。在贮藏期间，由于肌球蛋白构象的改变和破坏，致使酶活中心崩塌，Ca2＋-ATPase 活性下降。同时，Ca2＋-ATPase 活性与巯基的氧化密切相关，尤其是肌球蛋白头部的巯基[21]。

2.2 贮藏期间南美白对虾总巯基、羰基的变化

总巯基含量是衡量蛋白质氧化程度的一个指标。由图2 可知，新鲜样品的总巯基含量随着贮藏时间的延长显著下降（P＜0.05），所得结果与Ca2＋-ATPase 活性一致，且总巯基在贮藏初期的下降趋势更加显著。Chen 等[22]发现-3 ℃的南美白对虾（L.vannamei）贮藏4 周后总巯基含量与0 周相比下降52.97%。本文与其研究结果相似，南美白对虾在贮藏期间总巯基逐步下降，下降的原因可能是半胱氨酸残基巯基被氧化成二硫键[23]。

图2 微冻过程中南美白对虾总巯基、羰基的变化Fig.2 Changes in total sulfhydryl content，carbonyl content of L.vannamei during partial freezing

由氨基酸残基衍生的羰基化合物的形成被认为是评价蛋白质氧化的可靠指标，这些氨基酸主要在肌原纤维蛋白中被检出，肌原纤维蛋白是食品中蛋白质的主要成分[24]。新鲜样品的羰基含量随贮藏时间的延长显著上升（P＜0.05），此变化与总巯基含量的变化趋势相反。随着贮藏时间的延长，水产品中肌原纤维蛋白的某些氨基酸残基受到自由基的攻击，氧化成羰基，因此羰基含量上升[18]。

2.3 贮藏期间南美白对虾TCA 溶解肽、MFI 的变化

TCA 溶解肽含量反映了蛋白质的降解情况[25]，TCA 溶解肽含量高，表明蛋白质降解程度高。由图3 可知，与新鲜的虾相比，随着贮藏时间的延长TCA 溶解肽显著增加（P＜0.05），TCA-溶解肽含量从初始值（1.42±0.14）μmol 酪氨酸/g 肌肉增长到30 d 的（6.29±0.14）μmol 酪氨酸/g 肌肉。初始水平（作为酪氨酸当量）可能表示水产品中的内源性寡肽以及收获后处理过程中产生的降解产品。TCA 溶解肽在贮存过程中含量的增加可能表明内源性和微生物蛋白酶的活动，蛋白质持续发生溶解[26]。

图3 微冻过程中南美白对虾TCA 溶解肽、MFI 的变化Fig.3 Changes in TCA soluble peptides，MFI of L.vannamei during partial freezing

肌原纤维小片化指数（MFI）作为肌原纤维蛋白降解的有用标志，既可以评估剪切力和肉嫩度，也可以评估肌原纤维内部结构受到破坏的程度[27]。在本试验中随着贮藏时间的延长，MFI 显著增加（P＜0.05），且在贮藏15 d 后MFI 值增加速率加快。蛋白质的网状结构被破坏，使蛋白质网状结构的强度降低，特别是构成肌纤维束膜中的粗丝更容易溶解，导致MFI 值增加[28]。

2.4 贮藏期间南美白对虾分子作用力的变化

离子键、氢键、疏水相互作用和二硫键是维持蛋白质三维网络结构的作用力。从表1 可以看出，随贮藏时间延长，离子键、氢键下降，而二硫键、疏水相互作用力上升。由于蛋白质分子内部的巯基基团在微冻过程中被氧化成二硫键，蛋白质原有的结构可能会受到化学键变化的影响。二硫键的形成导致肌凝蛋白重链聚集，肌原纤维蛋白的盐溶性降低，导致离子键含量降低。此外，由于微冻贮藏期间蛋白质的展开和芳香族氨基酸的暴露，疏水相互作用力含量增加，氢键的数量随着疏水相互作用的减少而增加[29]。

表1 微冻过程中南美白对虾分子作用力的变化Table 1 Changes in intermolecular bonds of L.vannamei during partial freezing

2.5 贮藏期间南美白对虾内源荧光强度的变化

色氨酸荧光检测广泛应用于跟踪蛋白质的三级结构变化，因为色氨酸残留物的内在荧光对微环境的极性和荧光能量特别敏感[30]。当蛋白质是折叠状态时，色氨酸残基主要位于蛋白质内核的疏水环境中，此时被激发的色氨酸的荧光强度相对较高。图4 为微冻过程中南美白对虾内源荧光强度的变化，在激发波长295 nm 的新鲜虾肉的肌原纤维蛋白在335.93 nm 处具有最高的荧光强度，随着贮藏时间的延长，内源荧光强度出现不同程度的降低，且在贮藏前期内源荧光强度大幅度降低，随后逐渐降低。荧光强度的逐渐降低表明长期的贮藏会导致虾肉肌原纤维蛋白色氨酸残基的暴露和三级结构的变化。

图4 微冻过程中南美白对虾内源荧光强度的变化Fig.4 Changes in endogenous fluorescence intensity of L.vannamei during partial freezing

2.6 贮藏期间南美白对虾SDS-PAGE 的变化

SDS-PAGE 电泳图谱中蛋白质条带的弱化、消失或新条带的出现都是蛋白质变性、降解的具体体现[31]。图5 可以看到肌球蛋白重链和轻链、肌动蛋白、原肌球蛋白和尚不明了的结构性调节蛋白条带，样品在贮藏期间蛋白质发生一定的变化，分子质量175 ku 附近的蛋白质在20 d 电泳条带发生降解，分子质量95 ku 附近的条带在逐渐消失，在17～23 ku 之间条带密度清晰而在贮藏后期减弱甚至消失，推测这些蛋白质与对虾品质的变化相关，可能是由于外源蛋白酶将大分子质量的蛋白质降解形成小分子质量的蛋白质。电泳分析结果表明，在贮藏期间虾肉肌肉蛋白质发生降解，且贮藏时间长，蛋白质降解程度高。

图5 微冻过程中南美白对虾SDS-PAGE 的变化Fig.5 Changes in SDS-PAGE of L.vannamei during partial freezing

2.7 径向基函数神经网络预测模型的建立

SPSS（Statistical package for the social science）软件不仅具有数据管理、统计分析、图表分析、输出管理等基本统计功能，而且相比于Metlab等软件，使用SPSS 建立RBFNN 模型免去了繁琐的编程，具有简便、易操作的特点[32]。南美白对虾在-3 ℃微冻贮藏过程中，蛋白质品质指标的试验值用于RBFNN 模型的建立。图6 是RBF 神经网络结构，从右到左依次是输入层、隐藏层、输出层。在本次试验预测模型的建立中，输入层有10 个单元；隐藏层有8 个单元，激活函数为Softmax，隐藏层的单元是系统根据原始记录特性计算的最佳结构组成的；输出层有7 个单元，激活函数为恒等式函数，误差函数为平方和函数。

图6 RBF 神经网络结构Fig.6 RBF neural network structure

2.8 径向基函数（RBF）神经网络预测模型的验证

为了验证径向基函数（RBF）神经网络预测模型对南美白对虾微冻过程中蛋白质品质的预测效果，将模型对各指标的预测值和实测值进行比较，分别计算各指标预测值和实测值之间的均方误差（MSE）和决定系数（R2），展示得出预测模型对每个指标的拟合效果，同时，通过计算模型对每个指标预测值与实际值之间的相对误差来评价RBF神经网络模型对每个指标预测的准确性。预测模型相对误差的可接受范围为±10%，由表2 可知，建立的RBF 神经网络预测模型的相对误差均在±10%以内，试验结果整体显示RBF 神经网络模型预测的准确度高，可以成为微冻贮藏过程中南美白对虾蛋白质品质监测可靠的模型。

3 结论

本试验首先对微冻贮藏期间南美白对虾肌肉蛋白质品质特性指标进行测定，与鲜虾相比，不同的试验组的肌肉蛋白均发生了不同程度的变性、氧化和降解，表现为表面疏水性、羰基含量、TCA溶解肽、肌原纤维小片化指数上升；Ca2+-ATPase、总巯基含量下降。化学作用力的结果显示贮藏时间延长，引起离子键、氢键含量上升和疏水相互作用力、二硫键含量的下降。通过色氨酸荧光强度的测定发现，贮藏30 d 后荧光强度显著降低，表明色氨酸所处的微环境发生了变化。SDS-PAGE 图谱也显示贮藏后期，大分子蛋白发生了不同程度的降解。最后利用SPSS 软件建立RBFNN 模型，该模型的相对误差均在±10%以内，具有较高的预测精度和较好的拟合特性，可作为一种肌肉蛋白质品质变化的监测模型，能够较好地预测微冻南美白对虾的肌肉蛋白质品质变化。