补肺活血胶囊对肺纤维化模型小鼠的治疗作用及对PI3K/Akt 信号通路的影响

姜博涵，张宁，郭亚丽，王玉光*

1.北京中医药大学，北京 100029

2.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010

特发性肺纤维化（IPF）是慢性、渐进性、纤维化性肺疾病，临床表现为进行性呼吸困难、活动耐力下降、低氧血症以及呼吸衰竭[1]。IPF 的病理特征为普通型间质性肺炎（UIP），表现为远端肺实质中出现片状纤维化重构区域及成纤维母细胞灶。近年来，IPF 发病率逐年上升，中位生存期仅2～3 年[2]。现代医学以吡非尼酮和尼达尼布等抗纤维化治疗为主，虽能一定程度上延缓肺功能下降，延缓疾病进展，但存在较多不良反应[3]。

中医学将IPF 归为“肺痹”“肺痿”范畴，认为其病机为本虚标实，以肺、脾、肾亏虚，尤以肺气亏虚为主，痰、瘀、热互结致病[4-5]。本病源于气虚血瘀，肺肾亏虚，痰瘀互结，故临床中常以益气活血、补肺固肾疗法为主[6-7]。补肺活血胶囊由黄芪、赤芍、补骨脂组成，具有益气活血、补肺固肾的功效[8]。临床研究表明，补肺活血胶囊治疗IPF 疗效明显，可以一定程度上延缓肺功能下降，提高活动耐力，改善临床症状及生活质量[9]，但其抗纤维化作用机制尚不明确。磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路主要参与细胞生长、分化、凋亡和血管生成等过程，是调控肺纤维化的重要通路[3,10]。本研究通过观察羟脯氨酸（HYP）、Ⅰ型胶原蛋白（COL-I）、纤连蛋白1（Fn1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）和磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）的表达情况，分析补肺活血胶囊对于PI3K/Akt 通路的调控作用，探究其对IPF 的作用及机制。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级C57BL/6J 雄性小鼠60 只，年龄7～8 周，体质量20～24 g，购自北京维通利华实验动物技术公司，许可证编号（京）2021-0007，饲养于北京市中医研究所，饲养条件为SPF 级，每日动物处于12 h 光照/12 h 黑暗交替环境（温度22～25 ℃，湿度60%～70%），通风良好，常规颗粒饲料喂养，摄食饮水自由，适应性饲养1 周。动物实验经北京中医医院研究所伦理委员会批准（批准号BJTCM-M-2021-05-02）。

1.2 药物与试剂

补肺活血胶囊由广东雷允上药业有限公司生产，规格0.35 g/粒，产品批号20220309。吡非尼酮由北京康蒂尼药业有限公司生产，产品批号 150816；注射用盐酸博来霉素由浙江翰辉制药有限公司生产，产品批号15374。4%多聚甲醛（北京兰杰柯科技有限公司，批号BL.539A）；无水乙醇（中国医药集团有限公司，批号10009218）；二甲苯（中国医药集团有限公司，批号10023418）。伊红（MDL）、苏木素染液（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号ZLI-9609），Masson 三色染色试剂盒（索莱宝，批号G1340），Van Gieson 染色液（LEAGENE，批号DC0047），Mouse HYP ELISA Kit（MDL，批号MD120463），TRIZOL 试剂（Invitrogen，批号10296028），异丙醇（中国医药集团有限公司，批号40064360），核酸酶抑制剂（MDL，批号MD911875），UltraPure Agarose（ABI-invitrogen，批号6500100），SuperScript III RT 逆转录kit（ABI-invitrogen，批号11752050），Sybr qpcr mix（ABI-invitrogen，批号4472920），Citrate 柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）（北京中杉金桥生物技术有限公司，ZLI-9064），磷酸盐缓冲液（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号ZLI-9061），DAB kit（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号ZLI-9017），磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）抗体（Affinity，批号AF3241），磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）抗体（Affinity，批号AF0016），通用型SPkit（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号SP-9000），封闭液（武汉博士德生物工程有限公司，批号AR0150），抗体稀释液（武汉博士德生物工程有限公司，批号AR1016）。

1.3 实验仪器

ASP200S 型全自动脱水机（德国Leica 公司），RM2235 型石蜡切片机（德国Leica 公司），HI1220型烤片台（德国Leica 公司），HI1220 型水浴缸（德国Leica 公司），G1150 H 型加热石蜡包埋系统（德国Leica 公司），DM3000 型显微镜（德国Leica 公司），DM3000 型正置荧光显微镜（德国Leica 公司），550 型酶标仪（美国BIO-RAD 公司），GL-88B 型旋涡混匀器（海门市其林贝尔公司），AXTGL16M 型离心机（湖南恒诺仪器设备公司），LEGEND MICRO 21R 型台式高速冷冻离心机（美国THERMO 公司），Nanodrop lite 型分光光度计（美国THERMO 公司），StepOne Software 型荧光定量PCR 仪（美国Applied biosystems 公司)，EPS 300 型电泳仪（美国BIORAD 公司），2500 型凝胶成像仪（美国BIO-RAD公司），移液器（德国Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1 分组、造模与给药

将60 只C57BL/6J 小鼠分为5 组，每组12 只，分别为对照组、模型组、吡非尼酮组及补肺活血胶囊高、低剂量组。除对照组外，其余各组小鼠建立肺纤维化模型，即单次气管内滴注博来霉素，剂量为5 mg/kg。

参考相关文献方法[11]，于造模后第1 天开始干预治疗，对照组、模型组按实际体质量ig 等量生理盐水10 mg/(kg∙d)，1 次/d。吡非尼酮组按实际体质量ig 吡非尼酮200 mg/kg。按补肺活血胶囊说明书，以成人（60 kg）4 200 mg/d 的标准剂量换算，则小鼠等效剂量为4 200 mg/d÷60 kg×70 kg×0.002 6/20 g≈630 mg/(kg∙d)，补肺活血胶囊高、低剂量（临床标准剂量）组分别ig 配制好的补肺活血胶囊630、315 mg/(kg∙d)，1 次/d。连续给药28 d 后取材。

2.2 小鼠一般情况观察

实验过程中观察小鼠一般情况，包括精神状态、活动程度、呼吸频率、进食量和皮毛色泽等。记录各组小鼠体质量变化和死亡数量等。

2.3 肺组织病理切片观察

取小鼠肺组织右下叶，用4%多聚甲醛溶液固定24 h 后，常规脱水、石蜡包埋、切片，脱蜡后，再分别用苏木精–伊红（HE）和马松（Masson）的试剂盒染色。然后将切片浸入95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ各1 min，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ中各3 min脱水，脱水后将切片浸入二甲苯Ⅰ溶液和二甲苯Ⅱ溶液中各3 min，最后将切片晾干，封片。在光学显微镜下对小鼠肺组织病理切片进行观察并摄片。

2.4 肺组织HYP 含量测定

采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组小鼠肺组织HYP 水平。分别设标准孔、空白孔与待测样品孔。标准孔依次加入100 μL 不同浓度（0、2.5、5、10、20、40 ng/mL）的标准品溶液；空白孔加入100 μL 标准品稀释液，待测样品孔加待测样品100 μL，在酶标板上盖上覆膜，37 ℃温育1 h。洗板5 次，洗涤后用吸水纸彻底拍干。各孔中加入显色剂A 100 μL，酶标板覆盖，37 ℃温育30min，弃去孔中液体，洗板5 次，拍干；再向各孔中加入显色剂B 100μL，37 ℃温育30 min，弃去孔中液体，洗板5 次，拍干。在20-25℃下避光反应10min 后，各孔加入50μL 终止液终止反应。立即将反应板置于已设好波长的450nm 的酶标仪，在30min 内读出OD 值。按照样品读数及稀释浓度计算出小鼠肺组织HYP 水平。

2.5 RT-qPCR 法检测肺组织COL-Ⅰ、Fn1 和α-SMA的mRNA 相对表达水平

采用Trizol 法提取样本总RNA，使用核酸浓度测定仪测定RNA 浓度和纯度。逆转录合成cDNA，以β-actin为内参，进行PCR 的扩增。反应总体积为20 μL，反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，重复40个循环，熔解曲线分析，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s，采用2−△△Ct法计算COL-Ⅰ、Fn1、α-SMAmRNA 相对表达量，引物序列见表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

2.6 肺组织p-PI3K 和p-Akt 蛋白表达水平

将肺组织依次进行4%多聚甲醛固定、包埋、切片、脱蜡、抗原修复。3%过氧化氢溶液孵育10 min30 min。滴加适宜浓度的一抗置湿盒中4 ℃孵育过以消除内源性过氧化物酶活性，在湿盒中室温封闭夜。滴加生物素化二抗工作液，室温置湿盒中孵育20 min，加入DAB 显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色，苏木素染色液复染3 min，自来水冲洗；1%的盐酸酒精分化数秒、冲洗返蓝，乙醇梯度脱水、二甲苯透明、封片。用40 倍显微镜分析切片，并用Image J软件进行评分。

2.7 统计学方法

分别采用IBM SPSS Statistics 25.0、GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行统计分析、做图。计量资料符合正态分布用表示，不符合正态分布用中位数和四分位间距表示。两组间比较符合正态分布采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析；组间比较不符合正态分布采用非参数检验。

3 结果

3.1 小鼠体质量与生活状态观察

造模及给药后，对照组小鼠一般状态较好，精神状态佳，反应敏捷，活泼好动，进食、饮水量正常，皮毛光亮，尾部无缺损。模型组小鼠精神状态较差，反应缓慢，活动量明显减少，进食量减少，饮水量减少，体型瘦弱，皮毛晦暗无光、凌乱，较多小鼠尾部出现缺损。补肺活血胶囊高剂量组与吡非尼酮组小鼠一般状态表现接近，反应较缓慢，活动量稍减，进食、饮水量减少，皮毛尚有光泽，部分尾部出现缺损，均优于补肺活血胶囊低剂量组与模型组。对照组无小鼠死亡，模型组小鼠死亡3 只，吡非尼酮组死亡2 只，补肺活血胶囊高剂量组死亡2 只，补肺活血胶囊低剂量组死亡3 只。

由表2 可知，给药7 d 后，吡非尼酮组与模型组小鼠体质量最低，吡非尼酮组小鼠体质量较低可能与前期小鼠ig 给药时不配合相关，给药14、28 d，小鼠体质量由高到低排序为对照组、补肺活血胶囊高剂量组、吡非尼酮组、补肺活血胶囊低剂量组、模型组。

表2 造模后各组小鼠体质量变化（n=12）Table 2 Changes of body weight of mice in each group after modeling (n =12)

3.2 HE 染色结果

如图1 所示，对照组小鼠肺组织结构清晰正常，轮廓完整，肺泡间隔未见明显增厚，未见明显渗出及炎性细胞浸润。模型组小鼠肺组织见肺泡结构明显破坏，肺泡间隔增厚或（和）断裂，纤维组织增生明显，可见胶原沉积，肺泡腔内可见明显炎性细胞浸润。与模型组比较，补肺活血胶囊低、高剂量组及吡非尼酮组小鼠肺组织上述病理变化均有不同程度的好转，肺泡融合塌陷较少，肺组织结构较完整，病变范围局限，炎性渗出物减少。

图1 各组小鼠肺组织病理变化（HE 染色，×20）Fig.1 Pathological changes of lung tissue of mice in each group (HE staining,×20)

3.3 Masson 染色结果

如图2 所示，对照组小鼠肺组织结构清晰正常，轮廓完整，肺泡间隔未见明显增厚，未见明显渗出及炎性细胞浸润。模型组小鼠肺组织见肺泡结构明显破坏，肺泡间隔增厚或（和）断裂，纤维组织增生明显，可见胶原沉积，肺泡腔内可见明显炎性细胞浸润。与模型组比较，补肺活血胶囊高剂量组、补肺活血胶囊低剂量组、吡非尼酮组小鼠肺组织蓝色胶原纤维的沉积不同程度地减少。

图2 各组小鼠肺组织病理变化（Masson 染色，×20）Fig.2 Pathological changes in lung tissue of mice in each group (Masson staining,×20)

3.4 各组小鼠肺组织中HYP 含量比较

如表3 所示，与对照组相比，模型组小鼠肺组织中HYP 含量显著增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，补肺活血胶囊低、高剂量组及吡非尼酮组小鼠肺组织中HYP 含量均显著降低（P＜0.05、0.01）；与补肺活血胶囊低剂量组相比，补肺活血胶囊高剂量组、吡非尼酮组小鼠肺组织中HYP 含量显著降低（P＜0.01）；补肺活血胶囊高剂量组与吡非尼酮组小鼠肺组织中HYP 含量接近，差异无统计学意义。

表3 各组小鼠肺组织HYP 含量比较（, n=12）Table 3 Comparison on HYP content in lung tissue of mice in each group (,n=12)

表3 各组小鼠肺组织HYP 含量比较（, n=12）Table 3 Comparison on HYP content in lung tissue of mice in each group (,n=12)

与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与补肺活血胶囊低剂量组比较：△△P＜0.01**P < 0.01 vs control group;#P＜0.05 ##P < 0.01 vs model group;△△P <0.01 vs Bufei Huoxue Capsules low dose group

3.5 各组小鼠肺组织中COL-Ⅰ、Fn1 和α-SMA mRNA 相对表达水平比较

如表4 所示，与对照组相比，模型组小鼠肺组织中COL-Ⅰ、Fn1、α-SMA的mRNA 相对表达量均显著上调（P＜0.01）；与模型组相比，补肺活血胶囊高剂量组、吡非尼酮组小鼠肺组织中COL-Ⅰ、Fn1、α-SMAmRNA 相对表达量均显著下调（P＜0.01）；与模型组相比，补肺活血胶囊低剂量组小鼠肺组织中COL-ⅠmRNA 相对表达量下调（P＜0.05），Fn1、α-SMA的mRNA 相对表达量的差异无统计学意义；与补肺活血胶囊低剂量组相比，补肺活血胶囊高剂量组、吡非尼酮组小鼠肺组织中COL-Ⅰ的mRNA 相对表达量显著下调（P＜0.01），α-SMA的mRNA 相对表达量下调（P＜0.05），Fn1的mRNA相对表达量差异无统计学意义。

表4 各组肺组织中COL-I、Fn1 和α-SMA 的mRNA 相对表达水平（, n=12）Table 4 Relative mRNA expression levels of COL-Ⅰ,Fn1 and α-SMA in lung tissues of each group (,n=12)

表4 各组肺组织中COL-I、Fn1 和α-SMA 的mRNA 相对表达水平（, n=12）Table 4 Relative mRNA expression levels of COL-Ⅰ,Fn1 and α-SMA in lung tissues of each group (,n=12)

与对照组比较：**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01；与补肺活血胶囊低剂量组比较：△P＜0.05 △△P＜0.01

3.6 各组小鼠肺组织中p-PI3K 和p-Akt 蛋白表达水平比较

如图3、表5 所示，与对照组相比，模型组小鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt 蛋白含量均显著上调（P＜0.01）。与模型组相比，补肺活血胶囊低、高剂量及吡非尼酮组小鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt 蛋白含量均显著下调（P＜0.05、0.01）。与补肺活血胶囊低剂量组相比，补肺活血胶囊高剂量组和吡非尼酮组小鼠肺组织中p-PI3K 蛋白表达量显著降低（P＜0.01），p-Akt蛋白表达量降低（P＜0.05）；补肺活血胶囊高剂量组与吡非尼酮组小鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt 蛋白含量接近，差异无统计学意义。

图3 p-PI3K 和p-Akt 免疫组化（Masson 染色，×40）Fig.3 Immunohistochemistry of p-PI3K and p-Akt (Masson staining,×40)

表5 各组小鼠肺组织p-PI3K 和p-Akt 蛋白表达水平（, n=12）Table 5 Expression levels of p-PI3K and p-Akt proteins in lung tissues of each group (,n=12)

表5 各组小鼠肺组织p-PI3K 和p-Akt 蛋白表达水平（, n=12）Table 5 Expression levels of p-PI3K and p-Akt proteins in lung tissues of each group (,n=12)

与对照组相比：**P＜0.01；与模型组相比：#P＜0.05 ##P＜0.01；与补肺活血胶囊低剂量组相比：△P＜0.05 △△P＜0.01**P < 0.01 vs control group;#P＜0.05 ##P < 0.01 vs model group;△P < 0.05 △△P < 0.01 vs Bufei Huoxue Capsules low dose group

4 讨论

在中医学中没有与IPF 完全相对应的病名，现代研究中将IPF 归属为“肺痿”“肺痹”者居多。“肺痹”滥觞于《黄帝内经》。《素问·玉机真脏论》曰：“风寒客于人，使人毫毛毕直，皮肤闭而为热……弗治，病入舍于肺，名曰肺痹，发咳上气”。《素问·痹论》曰：“风寒湿三气杂至，合而为痹……皮痹不已，复感于邪，内舍于肺……凡痹之客五脏者，肺痹者，烦满喘而呕，……淫气喘息，痹聚在肺……其入脏者死”。其所论之肺痹，多与皮痹相关，主要由于肺气亏虚、少阴不足、风寒湿邪入舍于肺而成，其证可见咳嗽，虚喘，胸中烦满，喘而呕。“肺痿”一词，源于《金匮要略·肺痿肺痈咳嗽上气病脉证治第七》：“热在上焦者，因咳为肺痿。肺痿治病，何从得之？师曰：或从汗出，或从呕吐，或从消渴，小便利数，或从便难，又被快药下利，重亡津液，故得之”“肺痿吐涎沫而不咳者，其人不渴，必遗尿，小便数，所以然者，以上虚不能制下故也。此为肺中冷，必眩，多涎唾……”。肺痿病因或为热在上焦，邪热伤阴；或因误治汗、吐、下伤阴；或消渴津液耗伤等，从而导致肺阴亏损和肺气虚冷、气不化津、津液不布、肺失濡养，导致肺叶萎弱不用。

本病总由肺气虚损，气不行血，以致瘀血内停，或肺气不足，气不布津，聚而成痰，日久肺肾亏虚，痰瘀互结。当属虚实夹杂、本虚标实之证。周平安教授认为，本病大致可分为早期，缓解期，急性加重期，晚期。气虚血瘀贯穿疾病的始终，久病后肺肾亏虚，故当以益气活血，补肺固肾法治疗为主[12]。补肺活血胶囊由黄芪、赤芍、补骨脂组成，其功效为补益肺肾，益气活血。临床研究表明[9]，补肺活血胶囊治疗IPF 疗效明显，可以在一定程度上改善肺功能，提高活动耐力，改善临床症状及生活质量。

大量研究证明，肺泡上皮细胞（AEC）在IPF 发病机制中的关键作用[13]，AEC 的持续损伤与异常修复促成了肺纤维化的形成。上皮细胞–间充质转化（EMT）亦是肺纤维化发展的关键过程[14]。在这一过程中，上皮细胞标志物E-cadherin 的表达降低，间充质细胞标志物如COL-Ⅰ、α-SMA 的表达上调[15]，促进了肺纤维化的发展。Fn1 属于纤连蛋白，通过与胶原特异性结合，为胶原的沉积构成基质支架[16]，与纤维化进程息息相关。本次研究结果表明，与模型组相比，补肺活血胶囊高剂量组小鼠的COL-I、Fn1、α-SMAmRNA 表达量均显著降低（P＜0.01），证明其抗纤维化的作用。

PI3K/Akt 信号通路为参与调控肺纤维化过程的重要通路，该通路通常由其受体酪氨酸激酶的激活触发，导致PI3K 从细胞质转位到质膜。这种易位激活了其催化亚基（p110a），进而诱导磷酸肌醇的磷酸化，导致第二信使（PI3,4-二磷酸和PI3,4,5-三磷酸）的形成，第二信使结合Akt 导致其结构的改变，暴露出2 个氨基酸残基，丝氨酸473 和苏氨酸308 分别被PDK1 和PDK2 磷酸化[17]。从而导致Akt的激活，诱导下游信号分子，最终导致肌成纤维细胞增殖活化，细胞质基质沉积，胶原堆积，纤维化形成。本次研究结果表明，与模型组小鼠相比，补肺活血胶囊高剂量组小鼠的p-PI3K，p-Akt 表达量均显著降低（P＜0.01），表示其作用机制与PI3K/Akt信号通路相关。

综上所述，补肺活血胶囊可能通过PI3K/Akt 信号通路发挥抗纤维化的作用，从而治疗IPF。本研究为补肺活血胶囊治疗IPF 提供了实验理论支持，但是尚且需要进行更加完备的临床试验和基础实验进一步验证和阐明其具体的作用机制。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突