褪黑素通过诱导铁死亡抑制食管鳞癌生长的机制研究

李敏，杨素清，王伟*，李洪峰，张慧欣

1.冀中能源峰峰集团有限公司总医院 骨科，河北 邯郸 056201

2.邯郸市第一医院 胸外科，河北 邯郸 056000

3.冀中能源峰峰集团有限公司总医院 消化科，河北 邯郸 056201

食管癌是常见消化系统恶性肿瘤，其主要组织病理学以食管鳞癌为主，发病率与死亡率较高，目前食管鳞癌的治疗方式以手术联合放化疗为主，由于肿瘤耐药性，患者5 年生存率很低，寻找新的治疗药物是提高患者生存率的重要途径[1-2]。铁死亡是细胞内铁依赖的脂质过氧化损伤导致的非凋亡性死亡，研究显示，铁死亡与肿瘤的发生发展密切相关[3]。褪黑素是由松果体分泌的吲哚类物质，具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节的作用，研究显示，褪黑素可抑制胃癌[4]、卵巢癌[5]等肿瘤细胞的增殖与迁移，促进肿瘤细胞的凋亡，且在食管癌中，褪黑素可协同5-氟尿嘧啶（5-FU）抑制食管癌细胞迁移与侵袭，促进细胞凋亡，提高5-FU 对食管癌细胞的敏感性[6]。溶质运载蛋白7 家族成员11（SLC7A11）是调节铁死亡的蛋白酶，在维持细胞内外的谷胱甘肽氧化还原平衡中发挥重要作用，SLC7A11 过表达可抑制铁死亡，与胃癌、乳腺癌等肿瘤的发展密切相关[7-8]。研究显示，SLC7A11 在食管鳞癌组织中表达水平升高，与食管鳞癌的临床分期、有无淋巴结转移、及分化程度、患者预后及新辅助化疗耐药有关[9]。因此，本研究通过探究褪黑素对食管鳞癌细胞铁死亡及对SLC7A11 表达的影响，旨在揭示褪黑素调控食管鳞癌细胞铁死亡的作用机制，为食管鳞癌的分子靶向治疗提供理论基础。

1 材料

1.1 细胞与动物

人食管鳞癌KYSE150 细胞购自中国科学院上海细胞库。5～6 周龄SPF 级BALB/c 雄性裸鼠，体质量16～20 g，购自武汉大学动物实验中心[生产许可证号SCXK（鄂）2019-0004]。所有实验按照《实验动物护理和使用指南》执行，均经过冀中能源峰峰集团有限公司总医院批准（动物实验伦理批号2022019）。

1.2 主要试剂与仪器

褪黑素（质量分数≥98%，货号M5250）、碘化丙啶（PI，规格10 mg，货号P4170）、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1，规格5 mg，货号SML0583）、铁含量检测试剂盒（货号MAK025）购自Sigma 公司；DMEM 培养基（货号10566016）购自美国Gibco公司；SLC7A11 过表达质粒及空载质粒（pcDNA）购自广州锐博生物科技有限公司；MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（货号E-CK-A341）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（货号E-BC-K318-M）购自Elabscience 公司；RIPA 裂解液（货号R0010）购自北京索莱宝生物科技有限公司；兔抗人SLC7A11（货号ab175186）、β-actin（货号ab8227）及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG 二抗（货号ab205718）购自Abcam 公司；总谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（货号S0052）、活性氧（ROS）检测试剂盒（货号S0033S）购自上海碧云天生物技术有限公司。

JEM-1230 透射电子显微镜购自日本电子公司；FACS Calibur 流式细胞仪购自美国BD 公司；Flexstation-3 多功能酶标仪购自美国 Molecular Devices 公司。

2 方法

2.1 铁死亡细胞模型的建立

KYSE150 细胞接种至DMEM 培养基常规培养，培养至对数期时，以每孔4×103个细胞接种至96 孔板中，分别使用浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L 的褪黑素处理KYSE150 细胞24 h，并单独设置空白组，MTT 检测细胞存活率。

另选择对数生长期的KYSE150 细胞，使用1.0 mmol/L 褪黑素处理KYSE150 细胞为褪黑素组；另设置褪黑素＋Fer-1 组，使用5 μmol/L Fer-1[10]与1.0 mmol/L 褪黑素共同处理KYSE150 细胞。褪黑素组、褪黑素＋Fer-1 组处理24 h，MTT 检测细胞活性[490 nm 处吸光度（A490）值]。

2.2 细胞分组

将KYSE150 细胞分成4 组，分别为对照组、褪黑素组、褪黑素＋pcDNA 组、褪黑素＋SLC7A11组。褪黑素组使用1.0 mmol/L 褪黑素处理24 h，褪黑素＋pcDNA（转染空载质粒）组、褪黑素＋SLC7A11（转染SLC7A11 过表达质粒）组先进行质粒转染，转染24 h 后，使用1.0 mmol/L 褪黑素处理24 h，每组设置6 个复孔。

2.3 细胞线粒体形态观察

离心收集各组处理的细胞，PBS 洗涤后，使用2.5%戊二醛4 ℃固定过夜，加入1%锇酸放置1 h，PBS 洗涤3 次，分别使用50%、70%、90%乙醇及丙酮脱水，包埋固化后，切成50～60 nm 的切片，3%醋酸铀–枸橼酸铅双染色，透射电子显微镜观察并拍照。

2.4 PI 染色检测细胞死亡

将各组处理后的细胞1 500 r/min 离心5 min，收集细胞，PBS 洗涤，加入70%乙醇4 ℃固定30 min，PBS 洗涤，加入500 μL PI（50 μg/mL）避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞死亡。

2.5 细胞内Fe2+及GSH 水平检测

离心收集各组处理的细胞，PBS 洗涤后加入RIPA 裂解液裂解2 h 后，分别使用铁含量检测试剂盒及总GSH 检测试剂盒检测细胞中Fe2+及GSH 的水平。

2.6 细胞中ROS 的检测

离心收集各组处理的细胞，PBS 洗涤后加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃孵育20 min，去除多余的液体，荧光酶标仪（488 nm 激发波长，525 nm 发射波长）检测荧光强度，荧光越强则表示ROS 的含量越高。

2.7 Western blotting 法检测SLC7A11 蛋白表达

离心收集细胞PBS 洗涤2 遍，加入RIPA 裂解液裂解，超声破碎3 min，12 000 r/min 离心20 min取上清，采用BCA 法进行蛋白定量，每组取25 μg蛋白煮沸变性后进行SDS-PAGE 电泳，转至PVDF膜后5%的脱脂牛奶封闭，加入兔抗人SLC7A11 和β-actin 抗体，4 ℃孵育过夜，再加入HRP 标记的羊抗兔IgG 二抗，室温孵育1 h，ECL 显色液显色，以β-actin 为内参，Image J 软件分析目的蛋白相对表达量。

2.8 裸鼠荷瘤实验

将BALB/c 裸鼠分为模型组、褪黑素组、褪黑素＋pcDNA 组、褪黑素＋SLC7A11 组，每组各10只。KYSE150 细胞使用PBS 调整细胞浓度为1×107个/mL，模型组与褪黑素组在无菌条件下，在裸鼠右侧腋下注射100 μL 细胞液，褪黑素＋pcDNA组、褪黑素＋SLC7A11 组按照同样方法在在裸鼠右侧腋下注射100 μL 分别转染过空载质粒（pcDNA）和SLC7A11 过表达质粒（SLC7A11）的KYSE150细胞，接种第8 天，褪黑素组、褪黑素＋pcDNA 组、褪黑素＋SLC7A11 组小鼠ip 给药25 mg/kg，2 d 给药1 次，给药剂量参考文献报道[6]，第23 天脱颈处死小鼠，取肿瘤组织，测量体积并称质量，免疫组化法检测肿瘤组织SLC7A11 蛋白表达。

2.9 统计学分析

3 结果

3.1 褪黑素诱导KYSE150 细胞铁死亡模型的建立

结果显示，不同浓度的褪黑素均可显著降低KYSE150 细胞增殖活性，当褪黑素浓度为 1.0 mmol/L 时，细胞存活率约70%，因此选用1.0 mmol/L 的褪黑素用于后续实验，见图1A。

图1 不同浓度褪黑素对KYSE150 细胞存活率（A）和褪黑素对铁死亡细胞模型（B）的影响Fig.1 Effects of different concentrations of melatonin on KYSE150 cell survival (A) and on iron-dead cell models (B)

为验证褪黑素通过铁死亡诱导KYSE150 细胞死亡，使用1.0 mmol/L 褪黑素与Fer-1 共同处理KYSE150 细胞。结果显示，与褪黑素组比较，褪黑素＋Fer-1 组KYSE150 细胞增殖活性显著升高，表明Fer-1 可逆转褪黑素对KYSE150 细胞的增殖抑制作用，见图1B。

3.2 褪黑素对KYSE150 细胞形态的影响

如图2 所示，透射电子显微镜观察细胞形态，褪黑素组细胞内的线粒体较对照组变小，线粒体膜密度增加；褪黑素＋SLC7A11 组细胞线粒体较褪黑素＋pcDNA 组正常，线粒体膜密度减少。

图2 透射电子显微镜观察细胞形态（×50 000）Fig.2 Cell morphology observed by transmission electron microscope (×50 000)

3.3 褪黑素对KYSE150 细胞死亡的影响

如图3 所示，死亡细胞的细胞核被PI 染成红色，褪黑素组KYSE150 死亡细胞数较对照组增多，褪黑素＋SLC7A11 组死亡细胞数较褪黑素＋pcDNA 组减少。

图3 褪黑素对KYSE150 细胞死亡的影响Fig.3 Effect of melatonin on KYSE1500 cell death

3.4 褪黑素对KYSE150 细胞内Fe2+水平的影响

与对照组比较，褪黑素组KYSE150 细胞内Fe2+水平显著升高（P＜0.05）；与褪黑素＋pcDNA 组比较，褪黑素＋SLC7A11 组细胞内Fe2+水平显著降低（P＜0.05），见表1。

表1 褪黑素对KYSE150 细胞内Fe2+水平的影响（，n =6）Table 1 Effect of melatonin on Fe2+ level in KYSE150 cells(,n =6)

表1 褪黑素对KYSE150 细胞内Fe2+水平的影响（，n =6）Table 1 Effect of melatonin on Fe2+ level in KYSE150 cells(,n =6)

与对照组比较：*P＜0.05；与褪黑素＋pcDNA 组比较：#P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs melatonin+pcDNA group

3.5 褪黑素对KYSE150 细胞内ROS、GSH 水平的影响

与对照组比较，褪黑素组KYSE150 细胞内GSH 水平显著降低，ROS 水平显著升高（P＜0.05），DCF 荧光强度增加；与褪黑素＋pcDNA 组比较，褪黑素＋SLC7A11 组细胞内GSH 水平显著升高，ROS水平显著降低（P＜0.05），DCF 荧光强度降低，见图4、表2。

表2 褪黑素对KYSE150 细胞内ROS、GSH 水平的影响（，n =6）Table 2 Effects of melatonin on ROS and GSH levels in KYSE150 cells (,n =6)

表2 褪黑素对KYSE150 细胞内ROS、GSH 水平的影响（，n =6）Table 2 Effects of melatonin on ROS and GSH levels in KYSE150 cells (,n =6)

与对照组比较：*P＜0.05；与褪黑素＋pcDNA 组比较：#P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs melatonin+pcDNA group

图4 DCFH-DA 荧光探针检测细胞内ROS 的变化Fig.4 Changes of intracellular ROS detected by DCFH-DA fluorescent probe

3.6 褪黑素对KYSE150 细胞SLC7A11 表达的影响

Western Blotting 结果显示，与对照组比较，褪黑素组KYSE150 细胞SLC7A11 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与褪黑素＋pcDNA 组比较，褪黑素＋SLC7A11 组细胞SLC7A11 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），见图5、表3。

表3 褪黑素对KYSE150 细胞SLC7A11 表达的影响 (,n =6)Table 3 Effect of melatonin on SLC7A11 expression in KYSE150 cells (,n =6)

表3 褪黑素对KYSE150 细胞SLC7A11 表达的影响 (,n =6)Table 3 Effect of melatonin on SLC7A11 expression in KYSE150 cells (,n =6)

与对照组比较：*P＜0.05；与褪黑素＋pcDNA 组比较：#P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs melatonin+pcDNA group

图5 各组KYSE150 细胞SLC7A11 蛋白表达情况Fig.5 SLC7A11 protein expression of KYSE150 cells in each group

3.7 褪黑素对荷瘤小鼠肿瘤体积与质量的影响

与对照组比较，褪黑素组肿瘤质量与体积显著降低（P＜0.05）；与褪黑素＋pcDNA 组比较，褪黑素＋SLC7A11 组肿瘤质量与体积显著降低显著升高（P＜0.05），见表4。

表4 褪黑素对荷瘤小鼠肿瘤体积与质量的影响（，n =10）Table 4 Effects of melatonin on tumor volume and mass in tumor-bearing mice (,n =10)

表4 褪黑素对荷瘤小鼠肿瘤体积与质量的影响（，n =10）Table 4 Effects of melatonin on tumor volume and mass in tumor-bearing mice (,n =10)

与对照组比较：*P＜0.05；与褪黑素＋pcDNA 组比较：#P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs melatonin+pcDNA group

3.8 褪黑素对荷瘤小鼠肿瘤组织SLC7A11 表达的影响

免疫组化结果显示，对照组肿瘤组织褐色或中褐色细胞较多，SLC7A11 呈强阳性表达，褪黑素组与褪黑素＋pcDNA 组细胞SLC7A11 阳性颗粒表达较对照组减少，褪黑素＋SLC7A11 组细胞SLC7A11阳性颗粒表达较褪黑素＋pcDNA 组增多，见图6。

图6 免疫组化检测肿瘤组织SLC7A11 蛋白表达（SP，×200）Fig.6 Immunohistochemical detection of SLC7A11 protein expression in tumor tissue (SP,×200)

4 讨论

褪黑素是一种吲哚类神经内分泌激素，在多种人类肿瘤中具有抗肿瘤的作用，通过诱导细胞周期阻滞，抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡和调节免疫等多种途径发挥抗癌作用[11]。为验证褪黑素对食管鳞癌的抑制作用，本研究建立食管鳞癌细胞裸鼠移植瘤模，ip 一定的褪黑素治疗后，结果显示，褪黑素可显著抑制食管鳞癌细胞裸鼠移植瘤的生长。除抗肿瘤作用，褪黑素还可增加肿瘤细胞对紫杉醇、多柔比星等化疗药物敏感性[12]。另有研究显示，褪黑素通过激活核因子E2 相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶-1（HO-1）信号通路抑制高葡萄糖诱导2 型糖尿病骨质疏松症的铁死亡[13]。铁死亡是一种依赖性的脂质过氧化物介导的细胞死亡方式，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关[14]。褪黑素对食管鳞癌细胞铁死亡的影响尚不清楚，本研究结果显示，使用 0.25～4.0 mmol/L 褪黑素均可显著降低KYSE150 细胞增殖活性，且使用1.0 mmol/L 褪黑素与铁死亡抑制剂Fer-1 共同处理KYSE150 细胞显示，Fer-1 可逆转褪黑素对KYSE150 细胞的增殖抑制作用，表明褪黑素可通过铁死亡诱导KYSE150细胞死亡。

铁死亡是一种铁依赖性氧化细胞死亡，GSH 是维持细胞内氧化还原平衡的重要成分，ROS 水平反映细胞抗氧化能力，细胞铁死亡发生时，表现为线粒体变小、线粒体膜密度增高、线粒体嵴减少或消失，细胞内抗氧化能力降低，细胞内ROS 大量生成，Fe2+升高，GSH 水平降低[15]。本研究使用1.0 mmol/L 褪黑素处理KYSE150 细胞24 h 后，细胞死亡数目增加，细胞线粒体变小，线粒体膜密度增加，细胞内Fe2+水平与ROS 水平升高，GSH 水平显著降低，符合铁死亡特征，表明褪黑素可诱导KYSE150 细胞铁死亡。

SLC7A11 为一种氨基酸转运蛋白，属于溶质载体家族成员，可与溶质载体家族3 成员2（SLC3A2）组成胱氨酸/谷氨酸反转运体，抑制胱氨酸/谷氨酸转运体可促进细胞铁死亡，导致SLC7A11 表达代偿性的增加，研究显示，SLC7A11 在肝癌、食管鳞癌等肿瘤中上调表达，SLC7A11 可通过摄取胱氨酸与合成还原性GSH 保护细胞损伤及铁中毒[16-17]。研究显示，SLC7A11 在食管鳞癌组织中上调表达，与淋巴结转移和患者预后差有关，且体外细胞实验显示，Nrf2 的过度激活可诱导SLC7A11 表达，降低放射治疗诱导的脂质过氧化水平，促进食管鳞癌放射抗性[10]。本研究结果显示，使用1.0 mmol/L 褪黑素处理KYSE150 细胞24 h 后，SLC7A11 表达水平降低；在乳腺癌中，二甲双胍可通过抑制SLC7A11 表达诱导乳腺癌细胞铁死亡[18]。为进一步探究褪黑素调控SLC7A11 对KYSE150 细胞的影响，将KYSE150 细胞转染过表达SLC7A11 质粒后，使用褪黑素处理，结果显示，与褪黑素＋pcDNA组比较，褪黑素＋SLC7A11 组细胞死亡数目减少，细胞线粒体变大，线粒体膜密度减少，细胞内GSH水平显著升高，Fe2+水平与ROS 水平降低，提示过表达SLC7A11 可逆转褪黑素诱导的铁死亡，表明褪黑素可通过抑制SLC7A11 表达诱导食管鳞癌细胞铁死亡。另外，本研究荷瘤小鼠实验显示，使用褪黑素给予小鼠腹腔给药治疗后，肿瘤组织SLC7A11 蛋白表达水平升高，而裸鼠右侧腋下注射SLC7A11 过表达质粒（SLC7A11）的KYSE150 细胞后载给予褪黑素，小鼠肿瘤质量与体积显著升高，证实褪黑素可通过抑制SLC7A11 表达抑制肿瘤升高。

综上所述，褪黑素通过抑制SLC7A11 表达，升高细胞内Fe2+水平与ROS 水平，降低GSH 水平，诱导食管鳞癌细胞铁死亡。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突