低磷胁迫下外源褪黑素对大麦幼苗根系发育的调控作用

马静玮,马增科,姚立蓉,汪军成, 司二静,孟亚雄,马小乐,李葆春,尚勋武,王化俊

(1.省部共建干旱生境作物学国家重点实验室/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室,甘肃兰州730070;2.甘肃农业大学农学院,甘肃兰州730070;3.甘肃农业大学生命科学技术学院,甘肃兰州730070)

大麦(HordeumvulgareL.)是世界上第四大谷类作物,是高质量的食品和酿造业的重要原料,具有抗旱、抗盐等特性[1];其适应范围广,耐瘠薄,是研究环境胁迫对植物影响的理想材料[2]。低磷胁迫一直是影响大麦生长发育的主要因素,大麦在进化过程中也演化出了各种适应机制来应对缺磷环境[3]。根系是植物最先感知营养胁迫的器官[4],也是最先做出反应的部位[5]。低磷胁迫下植物根系长度、表面积等参数均显著降低,但侧根密度、数量和细根比例增加,根系的平均直径降低[6,7]。逆境胁迫下,植物会通过促进更多有机酸的释放来与胁迫离子螯合,缓解逆境胁迫[8],也可通过增大根长和根表面积来提高磷素的吸附能力,促进生长[9]。褪黑素(MT)是一种胺类激素,是广泛存在于各种生物体中的优良抗氧化剂,可提高抗氧化酶活性,直接消除植物中的自由基,促进与抗氧化酶有关基因的表达,保护植物免受过度的氧化损害,保持细胞膜结构的完整性[10]。施用外源MT可以减少核桃活性氧(ROS)的积累,防止植株受到损伤,提高叶ROS的清除能力[11];盐胁迫下施加外源MT可以促进玉米种子萌发[12];外源MT主要通过减少ROS含量来缓解逆境胁迫[13],从而提高抗氧化酶活性,达到清除ROS目的[14,15]。抗逆育种和栽培一直是作物研究和生产实践所面对的重要课题。低磷胁迫下施加外源MT后大麦幼苗根系如何变化,外源MT是否对大麦所受的低磷胁迫具有缓解效应仍需探究。本研究以磷敏感型大麦品种GN42为材料,通过水培试验,分析了低磷胁迫下外源褪黑素对大麦幼苗根系表型特征、解剖构造、生理特征和相关基因表达的影响,以期为大麦抗逆育种和栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试大麦为经过前期筛选鉴定试验确定的磷敏感型材料GN42[16]。

1.2 试验设计

选取均匀一致的大麦种子用双氧水表面消毒,清水冲洗干净后,在铺有三层滤纸的培养皿中将其萌发,5 d后转移至人工气候室中清水培养3 d,再开始不同处理。人工气候室培养条件:相对湿度50%～70%;光强300 μmol m-2·s-1;25 ℃光照16 h和12 ℃黑暗8 h交替培养。试验设0.397 mmol·L-1KH2PO4(CK,正常磷供应)、0.039 7 mmol·L-1KH2PO4(LP,低磷)和0.039 7 mmol·L-1KH2PO4+30 μmol·L-1MT(LP+MT)三个处理。MT浓度是通过查阅相关文献[17,18]和预试验筛选出的适宜大麦幼苗生长的浓度。因为MT是光敏型物质,因而在避光条件下,采用加热法配置 MT溶液,并同营养液一起加入10 L水培箱中,营养液每3 d换一次,之后拍照观察MT处理后5 d、10 d、15 d、20 d的幼苗生长情况。营养液配置见表1。每个处理3个重复,每个重复有两株幼苗,幼苗用水培篮固定。

表1 营养液成分配置

1.3 测定项目和方法

1.3.1 根系形态指标测定

用根系扫描仪(Epson,Long Beach,CA,USA)扫描新鲜根部,用Win RHIZO软件(Quebec,QC,CAN)计算总长度、表面积和体积。

石蜡切片制作过程参考陆锦鸿[19]的方法。

1.3.3 DAB/NBT组织染色观察

1.3.5 H2O2含量测定

对多次点炉、拆开回火器和烧嘴，利用废布在炉口燃烧实验等措施进行分析，发现造成绿色、紫色回火器炸裂的主因是C排以上形成“锅盖”，炉内燃烧气氛上行受阻，导致回火器和防爆片炸裂；而“锅盖”成因主要是C5水冷套管内部有3个砂眼漏水，停炉后吹扫过程中，由于被汽化的水蒸汽比空气的比热大，冷却过程中带走热量更多，散热速度快，C排以上一些已熔化的铜在吹风时下落，下落至C排以上立即凝固，因此堵塞气体上行的缝隙，加之炉内上部电铜的重力作用，使得C排以上电铜形成一层密封严实的电铜块，即形成“锅盖”；点炉过程中，将易燃的废布、木块丢进炉口后，未见明显火焰、气流上升，则说明炉内气氛上升受阻。

称取0.1 g根系鲜样,在冰浴中用5 mL三氯乙酸(0.1% w/v)提取,冷冻离心15 min,取0.5 mL的上清液加入1 mL碘化钾(1 mol·L-1)和0.5 mL磷酸缓冲液(pH=7.0),在吸光度390 nm处比色,使用H2O2试剂标准曲线计算H2O2含量。

1.3.6 花青素含量测定

称取0.5 g新鲜植物样品,剪碎成5 mm左右碎片,加入1%盐酸甲醇提取液,放入摇床在避光条件下震荡18 h左右,直至叶片呈白色,离心后取上清液,在530和657 nm处测定吸光度。

1.3.7 相关基因表达量分析

RNA提取与检测:在处理15 d后,采集大麦幼苗根系和叶片,用锡箔纸包住后立即放入液氮中,储存在-70 ℃的冰箱中。总RNA的提取使用总RNA分离试剂盒(TIANGEN,北京,中国)。RNA完整性的检测用1%琼脂糖凝胶电泳,RNA浓度和纯度由核酸分析检测。

cDNA第一链合成:运用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(TIANGEN,北京)合成cDNA第一链,具体操作步骤参考说明书。

qRT-PCR分析:依据基因序列,设计花青素合成相关基因Hvant(Anthocyanin synthesis related genes)、MT合成基因Hvcomt(Melatonin synthesis gene)和根系磷转运蛋白相关基因Hvpht1;1(Root phosphorus transport related gene)的特异性引物用于其表达特性的分析,大麦内参基因用Hv-actin基因,荧光定量PCR的完成采用Super Real PreMix Plus(SYBR Green)(TIANGEN,北京),反应体系共20 μL,包含RNase-Free ddH2O 7.4 μL、反向引物0.6 μL(10 μM)、正向引物0.6 μL(10 μM)、1 μL cDNA(80 ng·μL-1)、0.4 μL 50×Rox Reference Dye、10 μL 2×SuperReal Premix Plus,每个处理设置3个重复。扩增程序包括95 ℃预变性15 min,95 ℃变性10 s,60 ℃延伸退火32 s,40个循环。扩增后,通过扩增和熔解曲线确认特异性,并利用2-ΔΔCT法对基因表达情况进行分析。

表2 qRT-PCR引物序列

1.4 数据分析

采用SPSS 22和Excel 2016软件分析数据及绘图,采用Duncan(D)法进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 低磷胁迫下施加外源MT后大麦幼苗根系表型的变化

与CK比较,低磷胁迫(LP处理)导致大麦幼苗根系总长度、体积和表面积分别下降了 4.80%～37.10%、6.80%～18.00%和6.00%～21.70%,除处理5 d后的根系总长度外均差异显著。低磷胁迫下添加外源MT(LP+MT)后,大麦幼苗根系总长度、体积和表面积与CK相比总体上依然呈下降趋势,但变化幅度减少,甚至三个性状出现增加现象,且基本上均显著高于LP处理(图1)。这说明,低磷胁迫对大麦幼苗根系生长有明显的抑制作用,而添加外源MT会促进低磷胁迫下大麦幼苗根系生长。

2.2 低磷胁迫下施加外源MT后大麦幼苗根系解剖构造的变化

解剖观察(图2)发现,低磷胁迫(LP处理)下大麦幼苗的根冠长度短于CK,低磷胁迫明显抑制了幼苗根冠厚度的增加。低磷胁迫下添加外源MT后,根冠厚度较CK明显变大,长度增加,外源MT明显促进了大麦幼苗根冠伸长,进一步证明MT对根系生长具有一定的促进作用。

图2 不同处理下大麦幼苗根部石蜡切片图

2.3 低磷胁迫下施加外源MT对大麦幼苗抗氧化特性的影响

2.3.1 花青素含量

花青素具有很强的抗氧化性,可以减少活性氧对植物组织造成的损害。与CK比较,低磷胁迫(LP处理)下,大麦幼苗植株花青素含量显著增加,增幅为35.0%～69.9%。低磷胁迫下外源添加MT后,花青素含量较CK增加8.4%～78.6%,其中在处理15和20 d时显著高于CK和LP处理(图3)。

图3 不同处理下大麦幼苗花青素含量

图4 外源MT对低磷胁迫下大麦幼苗根系含量及组织染色的影响

2.4 低磷胁迫下施加外源MT对大麦幼苗相关基因表达的影响

与CK比较,低磷胁迫(LP处理)下大麦幼苗根系和叶片中Hvant和Hvcomt基因表达量均呈下调趋势,其中根系中表达量分别下降了78.9%和13.5%,叶片中表达量分别降低了46.1%和80.1%;而Hvpht1;1基因呈上调表达趋势,表达量增加了72.1%。低磷胁迫下添加外源MT后,与CK比较,三个基因在根系中均上调表达,表达量分别增加了10.9%、96.2%和81.7%;叶片中的Hvant和Hvpht1;1也上调表达,表达量分别增加了48.3%和83.7%,但Hvcomt的表达量降低了78.5%。

3 讨论

3.1 外源MT对大麦幼苗根系影响

根系在改善土壤物理、化学性质和合成激素等方面有重要作用,对植物生长发育尤为重要[20]。Liu等[21]研究发现,MT可以提高干旱胁迫下番茄根系活力,促进根系形态建成和水分的吸收[22]。本试验结果也表明,在低磷胁迫下30 μmol·L-1MT可促进大麦GN42幼苗根系总长度、表面积和体积的增加,说明外源MT可以使作物在逆境胁迫下不断整合环境信号,调节生长发育。

根系解剖结构的研究对了解植物逆境胁迫适应机制起着重要作用,其变化可以直观反映植物抗逆性[23]。在正常生长的植物中,根尖细胞处于不断脱落和补充的动态平衡,调动着根冠细胞的变化,使植物能够进行一系列的生理和生化反应,从而成功地适应不利的环境[24]。本试验中,低磷胁迫下大麦幼苗根系的生长发育减缓,根冠厚度增加受抑制,而添加外源MT促进了GN42中根冠厚度的增加,这与Liu等[25]的研究结果一致。

图5 不同处理下大麦幼苗根系相关基因表达量

3.2 外源MT对大麦幼苗根系生理特征影响

3.3 外源MT对大麦幼苗根系基因表达量影响

花青素也可以提高植物的抗逆能力,是非常有效的自由基清除剂[31]。在葡萄中花青素合成相关基因SNAT2的过表达会导致MT积累增多[32]。本试验中,低磷胁迫促进了大麦幼苗植株中花青素的积累,使其含量增加,表现为植物茎部呈紫红色。同时,与CK比较,低磷胁迫下,GN42根系和叶片中Hvant和Hvcomt基因下调表达,Hvpht1;1基因上调表达,而外源MT施加后三种基因在根系中均上调,叶片中的Hvant和Hvpht1;1基因也上调表达。Hvpht1;1是一种高亲和性的PI转运蛋白,与植物根系密切相关[33],且大多数的PHT1基因在根部表达,参与磷素的吸收。在本试验中,低磷胁迫下GN42中Hvpht1;1的相对表达量在低磷胁迫下无论添加外源MT与否都提高,说明其对逆境胁迫下的植物生长过程起正调控作用。

4 结论

低磷胁迫会促进大麦幼苗根系ROS的积累,抑制根系生长发育。低磷胁迫下施加外源MT后大麦幼苗根系总长度、根表面积和根体积均有不同程度增加,根冠伸长也得到了较大的促进,根系中ROS积累减少,抗氧化能力增强,根系中相关基因上调表达,说明外源MT可通过抑制ROS的产生和提高抗氧化能力来减缓低磷胁迫对大麦根系生长的的不利影响。