青稞HvnWRKY26基因的克隆及表达分析

姚晓华,王 越,姚有华,景 刚,安立昆,白羿雄,吴昆仑

(1.青海大学,青海西宁 810016; 2.青海省农林科学院/青藏高原种质资源研究与利用实验室/青海省青稞遗传育种重点实验室/国家麦类改良中心青海青稞分中心,青海西宁 810016)

青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook. f.)属于禾本科大麦属作物,是栽培大麦的一个变种,因其成熟时籽粒的内外稃与颖果分离,籽粒裸露,故又称为裸大麦[1]。青稞遗传背景与大麦高度相似,主要分布在海拔4 000 m左右的青藏高原地区,是青藏高原藏族同胞们的主要口粮[2]。条纹病作为青稞生产上的重要病害,严重影响青稞的产量和品质[3]。目前发现的与青稞条纹病相关的基因较少。研究发现,过表达Rdg1a和Rdg2a基因均能够显著提高大麦对条纹病的抗性[4-7]。本课题组前期通过转录组测序,也发现3个与青稞条纹病相关的基因AGO1[2]、MEL1AGO[8]和RGA[9]。

WRKY是植物中最重要的转录因子之一,主要参与植物生物和非生物胁迫响应过程[10]。植物在受到病原菌攻击时,可以通过增强植物的抗性抵抗病原菌的侵染[11]。Abbruscato等[12]研究发现,敲除WRKY22基因后,水稻对稻瘟病的抗性水平降低;而在水稻中过表达WRKY22基因则可以提高转基因株系对稻瘟病的抗性。Chen等[13]研究发现,在烟草中过表达小麦抗旱相关基因TaWRKY10能够显著提高烟草的耐旱性和耐盐性。此外,WRKY转录因子还参与植物激素信号和MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号转导[14],如拟南芥AtMPK3/6能够通过磷酸化激活AtWRKY33转录因子的转录活性,诱导植保素的生物合成,从而抵抗灰霉菌(Botrytiscinerea)的侵染[15]。然而,WRKY基因对青稞条纹病的响应尚未见报道。

本课题组前期通过分析不同抗性青稞品种感染条纹病后的转录组测序结果,发现一个差异表达的WRKY基因家族成员。在此基础上,本研究对该基因进行了克隆,命名为HvnWRKY26。并对该基因编码蛋白的理化性质、系统进化以及抗条纹病胁迫时的表达模式进行分析,以期为进一步研究青稞HvnWRKY26基因的抗条纹病功能和抗病机理奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为抗病青稞品种昆仑14号和感病青稞品种Z1141,均由青海大学农林科学院作物栽培与育种所青稞研究室繁育保存。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取及cDNA的合成

用植物RNA提取试剂盒(TaKaRa,北京)提取昆仑14号和Z1141的叶片总RNA。参考姚晓华等[8]的方法检测RNA的浓度和纯度。用Prime-Script lst Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(TaKaRa,北京)将RNA反转录为cDNA,-80 ℃存储。

1.2.2 青稞HvnWRKY26基因的克隆

本课题组前期用条纹病菌侵染青稞抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141,然后对正常叶片和感病叶片进行转录组测序(由诺禾致源科技股份有限公司进行),结果发现一个差异表达的基因(基因ID:HORVU1Hr1G090190),并命名为HvnWRKY26。利用Primer 6.0设计该基因CDS区的扩增引物HvnWRKY26-F/R(表1)。以青稞叶片总RNA反转录获得的cDNA为模板,利用THUNDERBIRD SYBR qRCR Mix(TOYOBO,上海)进行PCR扩增。PCR扩增体系、反应程序以及琼脂糖凝胶电泳检测均参考姚晓华等[2]的方法。使用胶回收试剂盒(生物工程,上海)回收目的条带,将目的片段连接到pEasy-Blunt载体(全式金,北京)上,并转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞,挑取白斑单菌落进行阳性鉴定,挑选3个阳性克隆送至上海生物工程股份有限公司进行测序。

表1 本研究用到的引物信息

1.2.3 青稞HvnWRKY26基因的生物信息学分析

利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)对HvnWRKY26基因进行注释;利用ExPASY(https://web.expasy.org/compute_pi/)预测HvnWRKY26蛋白的理化性质。利用SignalP 4.1 (http://www.Detaibio.com/tools/signal-peptide.html)和TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMIHMM2.0/)预测HvnWRKY26蛋白的信号肽和跨膜结构。利用SPOMA( https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://swiss-model.expasy.org/)预测HvnWRKY26蛋白的二级结构和三级结构。利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)预测HvnWRKY26蛋白的保守结构域。将HvnWRKY26基因序列输入到植物基因组数据库Gramene(http://www.gramene.org/)中,从大麦参考基因组(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/release-63/plants/fasta/hordeum_vulgare/dna)中获取HvnWRKY26基因的启动子区域序列,用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析HvnWRKY26基因启动子区域的顺式作用元件。通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查询大麦(Hordeumvulgare)、野生二粒小麦(Triticumdicoccoides)、山羊草(Aegilopstauschii)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、黍(Panicumhallii)、粟(Setariaitalica)和狗尾草(Setariaviridis)中与青稞HvnWRKY26同源的WRKY蛋白,利用DNAMAN 6.0软件进行多序列比对。

从大麦参考基因组中获得与HvnWRKY26基因亲缘关系较近的5个WRKY基因家族成员;从水稻参考基因组中获得与HvnWRKY26基因亲缘关系较近的11个WRKY基因家族成员;从玉米参考基因组中获得与HvnWRKY26基因亲缘关系较近的17个WRKY基因家族成员。利用MEGA 7和ITOL(https://itol.embl.de/itol.cgi)构建上述基因编码蛋白的系统进化树。通过在线软件STRING 9.0 (http://string.embl.de/),以拟南芥、水稻和玉米的WRKY26蛋白为基础,进行蛋白互作网络分析。

1.2.4 青稞HvnWRKY26基因的表达模式分析

用Primer 6.0设计HvnWRKY26基因的qRT-PCR引物HvnWRKY26-SF/SR(表1)。以青稞抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141感染条纹病后的正常叶片和感病叶片的cDNA(500 ng·μL-1)为模板,以TC139057为内参基因(表1)[16]。用TB Green○RPremix Ex TaqTM(TaKaRa,北京)进行qRT-PCR扩增。PCR反应程序、反应体系均参考杨 雪等[9]的方法。用2-ΔΔCT法[17]计算HvnWRKY26基因的相对表达量,每个样品设3次生物学重复。利用SPSS进行显著性检测。

2 结果与分析

2.1 青稞HvnWRKY26基因的克隆及其编码蛋白的理化性质

以昆仑14号和Z1141的叶片总RNA反转录得到的cDNA为模板,以HvnWRKY26-F/R为引物,扩增到一条长度约1 000 bp的目的条带(图1a)。测序后分析发现,其完整开放阅读框为765 bp,可编码255个氨基酸,且昆仑14号和Z1141的碱基序列和氨基酸序列一致性均为100%。利用SMART对氨基酸序列进行保守结构域预测,发现该基因编码的蛋白具有典型的WRKY结构域(94～156 aa),属于WRKY基因家族(图1b)。

a:HvnWRKY26基因的PCR结果,M:DL2000;1:昆仑14号;2:Z1141。b:HvnWRKY26蛋白的保守结构域预测。c:HvnWRKY26蛋白的二级结构预测,蓝色:α-螺旋;红色:延伸链;绿色:β-转角;橙色:无规则卷曲。d:HvnWRKY26蛋白的三级结构预测。

理化性质分析表明,该基因编码的蛋白分子式为C1159H1783N345O359S12,分子量为26.68 KDa,不稳定指数为41.29,脂溶指数为64.41,理论等电点为5.62,其中负电荷残基(Asp+Glu)25个,正电荷残基(Arg+Lys)19个,平均疏水性指数(GRAVY)为-0.333。说明该蛋白是一个亲水性的不稳定酸性蛋白。跨膜结构和信号肽分析表明,该蛋白不存在跨膜结构,且无信号肽。

二级结构预测表明,该蛋白含有48.03%的无规则卷曲,35.83%的α-螺旋,9.84%的延伸链,以及6.30%的β-转角(图1c),推测α-螺旋和无规则卷曲这两个结构在蛋白行使功能时发挥重要作用。三级结构预测结果与二级结构预测结果基本一致(图1d)。Uniprot基因注释结果表明,该蛋白为WRKY26,被定位在细胞核内,因此将该基因命名为HvnWRKY26。

2.2 HvnWRKY26基因的顺式作用元件

分析结果(表2)表明,HvnWRKY26基因启动子区域含有丰富的顺式作用元件,包括脱落酸响应元件(ABRE)、茉莉酸响应元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)、干旱诱导响应元件(MBS)以及其他与逆境胁迫相关的顺式作用元件。此外还包括与赤霉素响应、生长素响应、光响应等相关的顺式作用元件。

表2 青稞HvnWRKY26基因启动子区域的顺式作用元件

2.3 HvnWRKY26蛋白的同源比较及系统进化分析

采用DNAMAN 6.0进行氨基酸序列比对,结果发现,青稞HvnWRKY26蛋白与大麦WRKY26、野生二粒小麦WKRY24、山羊草WKRY55、二穗短柄草WKRY41、黍WKRY30、粟WKRY53和狗尾草WRKY30的蛋白氨基酸序列一致性分别为81.10%、80.23%、82.17%、37.35%、33.33%、29.77%和27.42%。这些蛋白均具有高度保守的WRKY结构域,青稞HvnWRKY26蛋白的WRKY结构域序列与上述物种的一致性分别为100%、96.83%、95.24%、87.30%、87.30%、87.30%和87.30%(图2)。系统进化分析表明,青稞HvnWRKY26与大麦WRKY26的亲缘关系最近,与黍WKRY30、粟WKRY53和狗尾草WRKY30的亲缘关系较远(图3a)。进一步构建HvnWRKY26及其在大麦、水稻和玉米参考基因组中亲缘关系较近的WRKY蛋白的进化树,结果发现,这些蛋白被分为A、B、C三类。其中,HvnWRKY26与3个大麦成员、3个水稻成员和6个玉米成员聚为A类,说明这些蛋白的功能在进化上相对保守。

Hvn:青稞;Hv:大麦;At:山羊草;Td:野生二粒小麦;Bd:二穗短柄草;Ph:黍;Si:粟;Sv:狗尾草。图3同。红线表示WRKY结构域,黑线表示CX7CX23HXC锌指基序,蓝线表示WRKYGQK基序。

a:HvnWRKY26与其他七种禾本科植物WRKY蛋白的进化树分析。b:HvnWRKY26及其与亲缘关系较近的大麦、水稻和玉米WRKY蛋白的进化树分析,Os:水稻;Zm:玉米。

2.4 HvnWRKY26基因对青稞条纹病的响应

RNA-seq和qRT-PCR分析结果表明,与正常叶片相比,昆仑14号的感病叶片中HvnWRKY26基因的表达量分别提高15.58和59.69倍;Z1141的感病叶片中HvnWRKY26的基因表达量分别提高4.52和0.92倍,且该基因在昆仑14号感病叶片中的表达量极显著高于Z1141感病叶片(图4)。

KL14N:昆仑14号正常叶片;KL14S:昆仑14号感病叶片;ZN:Z1141正常叶片;ZS:Z1141感病叶片。相同分析方法图柱上不同大写字母表示样品间差异极显著(P<0.01)。

3 讨论

前人研究表明,WRKY转录因子参与调控植物的生长发育、衰老、抗逆性等过程[18]。本研究克隆到的HvnWRKY26基因具有典型的WRKY结构域,包含WRKYGQK基序(100～106 aa)和CX7CX23HXC锌指基序(120～154 aa),属于WRKY转录因子[19],是WRKY基因家族中的第三类亚家族[20]。HvnWRKY26与禾本科其他植物WRKY蛋白的氨基酸序列一致性不高,但WRKY结构域的序列一致性较高,推测WRKY结构域在调控功能基因的表达中起重要作用,但其是否在青稞抗条纹病中发挥作用有待进一步研究。

顺式作用元件是基因转录调控的重要分子开关[21]。在番茄中,LeWRKY1基因启动子区域具有茉莉酸响应元件,外源激素茉莉酸可诱导LeWRKY1基因的表达,并通过茉莉酸依赖的信号途径参与番茄对灰霉菌的防御响应过程[22]。本研究发现,HvnWRKY26基因启动子区域也具有多种响应生物和非生物胁迫相关的元件,如脱落酸响应元件(ABRE)、光响应元件(ACE、ATCT-motif、Box 4等)、茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)、防御应激反应元件(TC-rich repeats)等。Germain等[23]研究表明,白云杉防御素PgD1基因含有TC-rich repeats元件,过表达PgD1基因能能够显著提高白云杉对树脂假单胞菌的抗性。因此,推测HvnWRKY26基因启动子区域的TC-rich repeats元件可能在青稞抗条纹病过程中也发挥重要作用。

系统进化分析表明,青稞HvnWRKY26基因与12个WRKY基因家族成员(大麦3个,水稻3个,玉米6个)聚为一支,且都包含WRKYGQK基序。其中,大麦中的HORVU3Hr1G059220和水稻中的LOC_Os11g45850在Swiss-Prot中均被注释为WRKY53。Chujo等[24]研究表明,在水稻中过表达OsWRKY53,可诱导防御相关基因(包括抗病相关蛋白基因)上调表达,使水稻对稻瘟病的抗性增强。推测条纹病菌侵染青稞后HvnWRKY26基因与稻瘟病菌侵染水稻后OsWRKY53基因的抗病机制相似,但仍需进一步验证。

研究表明,许多WRKY基因与植物的抗病性有关,在植物对病原菌的抵抗中起着关键作用。在水稻中,OsWRKY24基因在稻瘟病侵染后上调表达[25];在小麦中,WRKY45的过表达增强了植株对白粉病和条锈病的抗性[26];在拟南芥中,AtWRKY33的过表达增强了对坏死真菌引起的灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和链格孢菌(Alternariabrassicicola)的抗性[27],AtWRKY45或AtWRKY1的过表达均可增强植株的抗病和耐旱能力[28-29]。本研究结果表明,青稞抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141在条纹病侵染后HvnWRKY26基因显著上调表达,且抗病品种的表达量显著高于感病品种,该结果与上述研究结果类似,推测具有类似的抗病机制。该研究结果为进一步研究青稞HvnWRKY26基因的抗病功能奠定基础。