长链非编码RNA在肾癌中的研究进展

林永帅 张发财 杨建军 梁国富 吴志平

肾癌又称为肾细胞癌，是一种常见的泌尿系统恶性肿瘤，主要起源于肾小管上皮[1]。2016年，WHO 将肾癌分为16 种不同的组织亚型，其中透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）、乳头状细胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）和嫌色细胞癌（chromophobe renal cell carcinoma，CHRCC）为最常见的病理类型，分别占比70%～90%、10%～15%和3%～5%[2]。肾癌发病率在全球范围内呈逐年上升趋势[3]，在男性所有癌症中占第6 位，在女性中占第10 位，分别占所有肿瘤诊断的5%和3%[4]。目前，肾癌诊断主要依靠CT 和MRI，由于对放化疗不敏感，早期肾癌主要依靠手术治疗[5]。近年来尽管肾癌治疗水平有了较大的提高，但患者预后仍然很差。据报道，约25%～30%的肾癌患者在初步确诊时存在转移性疾病，且在根治性肾切除术后仍有20%～40%的患者出现局部复发或转移[6]，给肾癌的诊断和治疗带来巨大的挑战。因此，寻找更有效的肾癌早期诊断、治疗方法和预测预后的新型生物标志物和靶点尤为重要。诸多研究表明，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）可作为预测预后的新型生物标志物和靶点，在多种恶性肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用。随着近年来高通量测序技术的发展，基于肿瘤标本的lncRNA 生物标志物的研究如火如荼。本文就lncRNA 在肾癌的发生、发展过程中发挥的作用作一综述，以期为肾癌的诊疗及预后评估提供新的思路和参考。

1 lncRNA

1.1 lncRNA 概述 人类基因组计划的研究结果表明，正常人类基因组中只有2%的RNA 序列用来编码蛋白质，其余的大部分为非编码RNA，类型包括lncRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）和环状RNA（circular RNA，circRNA）等[7]。lncRNA 是一类转录本序列长度超过200 个核苷酸、且不参与蛋白质表达的RNA分子，大部分位于细胞核或细胞质，也有一些lncRNA通过外泌体运输传播到相邻细胞或血清，约占非编码RNA 的80%[8-9]。lncRNA 在包括人类在内的所有脊椎动物中普遍存在，由于缺乏有意义的开放阅读框和蛋白质编码功能，lncRNA 曾经被认为是转录“噪音”或RNA 聚合酶Ⅱ转录的副产物，不具有生物学功能[10]。据估计，人体内已探明的lncRNA 数量超过60 000 个，而且这个数量还在快速增加[11]。到目前为止，只有极少数lncRNA 的功能被注释[12]。随着分子生物学的持续发展，lncRNA 的生理生化功能正在被逐渐认识。当前研究认为，lncRNA 能够与DNA、RNA 和（或）蛋白质分子相互作用，调节生物体的生理功能，涉及基因调控、转录和转录后的表观遗传控制，影响细胞稳态的各个方面，包括增殖、凋亡、生长周期、侵袭和转移[13]。lncRNA 在肿瘤细胞中差异表达，并且与健康细胞转化为肿瘤细胞直接相关。探讨lncRNA 在各种肿瘤疾病中的作用并寻找新的生物标志物和药物靶点成为今后生物学和医学研究的新热点。

1.2 lncRNA 分类 不同lncRNA 位于不同的基因组位置并从不同的基因组位置转录，根据所在基因组位置lncRNA 可分为5 类[14]，其中转录本来源于两条编码蛋白基因的间隔区域的lncRNA 被称为基因间lncRNA，来自注释基因内含子的被称为内含子lncRNA，来自编码蛋白基因反向互补链的被称为双向lncRNA，由蛋白编码基因的正义链转录而成的lncRNA 被称为正义lncRNA，主要指来自蛋白编码基因的外显子，那些位于注释转录单位的反义链上的lncRNA 则被称为反义lncRNA。

1.3 lncRNA 的功能 大多数lncRNA 需要在功能上进行验证，总结以往的研究可知，lncRNA 相关功能大致可分为5 类，一是调控表观遗传，如lncRNA HOX 转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是肾癌转移的重要启动子，HOTAIR 可影响组蛋白H3赖氨酸27（histone H3 lysine 27，H3K27）甲基化及其靶基因的表达，从而介导肾癌的转移[15]。二是充当诱饵，如p21 相关NcRNA DNA 损伤激活（p21 associated NcRNA DNA damage activated，PANDA）的lncRNA 可充当核转录因子NF-YA 的诱饵，以限制促凋亡基因的表达[16]。lncRNA 还充当共调节剂或共阻遏物，如被称为类固醇受体RNA 激活剂（steroid receptor RNA activator，SRA）的lncRNA 可作为多种核类固醇受体的共激活剂，通过调节真核基因的表达充当催化性的RNA 转录本[17]。一些lncRNA 可与miRNA 相互作用，Zhao 等[18]发现lncRNA HOTAIR 通过靶向抑制miR-20a-5p 调节乳腺癌中高迁移率族蛋白A2（high mobility group protein A2，HMGA2）的表达。此外，lncRNA 可作为miRNA 的宿主基因，如lncRNA H19 作为宿主基因反向调节miR-675 的释放，并抑制细胞增殖，从而响应细胞应激或癌变等相关信号的产生[19]。

2 lncRNA 影响肾癌发生、发展的机制

2.1 lncRNA 促进肾癌细胞增殖 正常细胞的生长依赖于生长因子的调节，但肿瘤细胞可以在很少或没有生长因子的情况下继续保持其增殖的能力[20]，而这一能力，可能与lncRNA 失调有关。Hong 等[21]研究发现，HOTAIR 在肾癌组织中显著上调，过表达HOTAIR 与肾癌患者的肿瘤-淋巴结转移TNM 分期呈正相关。HOTAIR 还通过靶向负调控miR-217 表达促进肾癌细胞的增殖和迁移。提示HOTAIR 可作为一种新的肾癌生物标志物和潜在的治疗靶点。Zhou 等[22]发现烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA（nicotinamide nucleotide transhydrogenase antisense RNA，NNT-AS）1 可通过miR-137/Y-盒结合蛋白1（Y-box binding protein 1，YBX1）途径促进ccRCC 的进展，敲除NNT-AS1 可明显抑制ccRCC细胞增殖，NNT-AS1 也因此被认为是ccRCC 的一个有意义的治疗靶点。Liu 等[23]发现，小核仁RNA 宿主基因（small nucleolar RNA host gene，SNHG）12 在肾癌中过表达，体外实验证明SNHG12 过表达会增加肾癌细胞增殖，而敲低SNHG12 表达则可显著降低肾癌细胞增殖、迁移和侵袭。从机制上讲，SNHG12 过表达提高了细胞分裂周期相关蛋白3 的水平，从而参与肾癌的发生、发展。相比于邻近正常组织，肾癌组织中lncRNA 核富集转录本（nuclear-enriched abundant transcript，NEAT）1 的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰更低，而NEAT1的高甲基化明显抑制了肾癌细胞的增殖[24]。lncRNA DNAJC3-AS1 可能通过调节miR-27a-3p/正性调节区锌指蛋白（PR domain zinc finger protein，PRDM）14 轴调控ccRCC 的进展，沉默lncRNA DNAJC3-AS1 则减少ccRCC 细胞的增殖、迁移和侵袭[25]。肾癌相关转录因子（renal cancer-associated transcript，RCAT）1 是肾癌的重要肿瘤启动子，肾癌组织中RCAT1显著上调，RCAT1通过保护E2F 转录因子（E2F transcription factor，E2F）2 免受miR-214-5p 介导的降解来促进肾癌细胞的增殖[26]。此外，lncRNA MIR4435-2HG 通过靶向miR-513a-5p/Kruppel 样锌指转录因子6（kruppel-like zinc finger transcription factor 6，KLF6）轴增加ccRCC 细胞的增殖和侵袭能力[27]。POU 3 类同源盒3（POU Class 3 Homeobox 3，POU3F3）过表达介导肾癌细胞中生长停滞特异性转录本（growth arrest-specific transcript，GAS）5 的下调，从而干预肾癌细胞的生长[28]。牛磺酸上调基因（taurine upregulated，TUG）1 能够通过抑制miR-196a 表达促进体外肾癌细胞增殖、迁移和侵袭[29]。

2.2 lncRNA 调控肾癌细胞的凋亡 细胞凋亡指在生理和病理条件下发生的有序和协调的程序性细胞死亡，细胞的功能性凋亡对器官发育和组织稳态至关重要[30]。细胞凋亡由许多配体启动，包括通过外源性途径调节特定的膜死亡受体和通过内源性途径调节线粒体中的B 细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白家族并介导凋亡[31]。肿瘤细胞可以通过多种方式逃避细胞凋亡，从而获得区别于正常生理细胞的凋亡抗性。lncRNA 在调控肿瘤细胞凋亡中发挥了不可或缺的作用。有研究表明，与正常细胞相比，肾癌细胞中特定的lncRNA 表达模式发生了变化。Chen 等[32]发现，结肠癌相关转录因子（colon cancer-associated transcript，CCAT）1 在肾癌组织和细胞系中的相对表达量明显高于对照组，敲除CCAT1 可降低细胞活力，加速肾癌细胞系的凋亡。进一步研究表明，CCAT1/Livin 轴可能在其中发挥着重要的作用，CCAT1 通过增强Livin蛋白稳定性并上调Livin 蛋白的表达水平，抑制肾癌细胞凋亡并增加细胞的活力。肾癌中浆细胞瘤变异易位（plasmacytoma variant translocation，PVT）1 基因通常表达上调，敲除肾癌细胞中的PVT1 可导致髓样细胞白血病（myeloid cell leukemia，Mcl）-1 基因的下调。研究表明，Mcl-1 是Bcl-2 家族的重要成员，可作为抗凋亡因子参与调节细胞死亡[33]。因此，上调PVT1 可导致肾癌细胞死亡信号抗性，使其存活率增加。SNHG16主要位于ccRCC 细胞的细胞质中，研究发现SNHG16可以显著抑制ccRCC 细胞的凋亡，其机制可能是SNHG16 作为竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）与ccRCC 细胞中的miR-1301-3p 相互作用，上调了STARD9 蛋白的表达[34]。此外，有研究报道lncRNA POU3F3 相邻非编码转录本（POU3F3 adjacent non-coding transcript，PANTR）1 是一种致癌的基因间lncRNA，来源于编码蛋白的POU3F3 基因，位于染色体2q12.1 上。在敲除PANTR1 后，肾癌细胞中负责直接执行人类细胞凋亡的半胱天冬酶（Caspases）-3 和Caspases-7 活性显著升高，从而诱导细胞凋亡[35]。体外和体内实验表明，敲除远端HOXA 转录物（HOXA transcript at the distal tip，HOTTIP）促进肾癌细胞凋亡作用可能部分通过激活Bcl-2/Caspase-3 通路来实现。进一步研究发现HOTTIP 可能通过促进EZH2 和LSD1 结合，在转录水平间接影响大肿瘤抑制激酶（large tumor suppressor kinase，LATS）2 的下游靶标表观遗传，从而导致肾癌细胞的抗凋亡[36]。在另一项研究中，尿路上皮癌胚抗原（urothelial carcinoma antigen，UCA）1 在晚期肾癌患者中表达显著升高，UCA1 作为miR-129 的ceRNA，增强了肾癌细胞中靶基因SRY 基因相关的HMG 盒（SRY-related HMG-box，SOX）4 的表达，UCA1 的下调可显著诱导细胞凋亡[37]。lncRNA DARS-AS1 通过miR-194-5p/DARS 信号传导在ccRCC中发挥抗凋亡作用[38]。lncRNA 母系表达基因（maternally expressed gene，MEG）3 过表达可降低Bcl-2 的表达并增强Caspase-9 蛋白的表达，推测其可能通过激活线粒体途径诱导肾癌细胞凋亡[39]。

2.3 lncRNA 影响肾癌细胞周期 细胞周期是一个高度调节的过程，使细胞生长、遗传物质复制和细胞分裂成为可能。完整的细胞周期包括DNA 合成前期（G1期）、DNA 合成期（S 期）、DNA 合成后期（G2期）、有丝分裂期（M 期）和处于静止状态的静止期（G0期）。细胞周期由核心细胞周期机制驱动，其物质基础包括细胞周期蛋白及其催化伙伴、细胞周期蛋白依赖性激酶等[40]。当前研究认为lncRNA 对肾癌细胞周期具有重要的调控作用。如lncRNA LOC653786 的沉默可降低叉头转录因子（forkhead transcription factor，FOX）M1 蛋白的表达从而诱导肾癌细胞周期停滞在G1期[41]。lncRNA 转移相关性肺腺癌转录本（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript，MALAT）1 通过降低miR-203 的表达减少G0/G1期肾癌细胞的百分比，而敲除MALAT1 则会逆转这一现象[42]。lncRNA KCNQ1DN在肾癌组织和细胞系中下调，敲除KCNQ1DN 可显著上调细胞周期蛋白D1，下调p27 mRNA 和蛋白质水平，并增强肾癌细胞的G1进程，而lncRNA KCNQ1DN的过表达则导致肾癌的G1期细胞周期停滞[43]。通过与EZH2 相互作用，lncRNA LINC-PINT 过表达导致肾癌的G1期细胞百分比显著下降，同时S 期细胞百分比增加[44]。此外，NEAT1 在肾癌组织和细胞系中上调，体外敲除试验发现，NEAT1 导致G0/G1期细胞积累，与对照相比，S 期细胞数量减少，这一过程可能是通过miR-34a/肝细胞生长因子受体（c-metprotoncogene，c-Met）轴实现的[45]。lncRNA GIHCG 能够加速肾癌细胞的细胞周期进程，敲除GIHCG 则显著抑制了肾癌细胞从G0/G1期向S 期的进展[46]。敲除Xist 基因5'端（five prime to Xist，FTX）抑制了肾癌细胞中G0/G1期的集落形成并导致细胞周期阻滞[47]。lncRNA X 染色体失活特异性转录本（X inactive specific transcript，XIST）的过表达在体外显著诱导细胞G0/G1停滞并在体内抑制肿瘤生长，其机制可能是lncRNA XIST 直接与miR-106b-5p 相互作用并增加p21 的表达，从而在肾癌中发挥抑癌作用[48]。

2.4 lncRNA 介导肾癌细胞上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） EMT 是一种赋予上皮肿瘤细胞间质特性的过程，包括减少黏附和增加运动性，EMT 过程中上皮细胞失去黏附连接，顶-基底外侧极性被剥夺，获得迁移潜力并转化为间充质表型，EMT 也被认为是癌症转移早期阶段的关键步骤[49]。在胚胎发育过程中，胚胎细胞通过EMT 以迁移到远处，随后遵循相反的过程，即间充质-上皮转换（mesenchymal-epithelial transition，MET），以分化成各种细胞类型。同样，癌细胞在原发性肿瘤分层期间重新激活EMT 程序，迁移到远处器官，并形成继发性肿瘤[50]。越来越多研究表明，lncRNA 通过与miRNA 竞争性结合、调节mRNA 表达水平及激活相关信号通路等方式影响EMT 过程，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。Hong 等[51]发现，肾癌细胞中lncRNA EMBP1 通过转录后机制结合并负调控miR-9-5p，敲除EMBP1，上皮标志物上皮钙黏蛋白E（E-cadherin）和claudin 蛋白上调，间充质标志物波形蛋白（vimentin）下调，表明EMBP1/miR-9-5p 轴通过调控细胞EMT 从而促进肾癌细胞的侵袭和转移。结直肠肿瘤差异表达（colorectal neoplasia differentially expressed，CRNDE）基因在ccRCC 组织及细胞系中高表达，通过靶向调控miR-136-5p，介导ccRCC 细胞EMT[52]。相关性分析证实，lncRNA LINC00961 的表达与肾癌患者特异性生存呈负相关，LINC00961 过表达可抑制EMT 相关的生物标志物Slug 和N-钙黏蛋白（N-cadherin）的表达，从而介导肾癌细胞在体内的转移[53]。而lncRNA LOC648987 可上调肾癌细胞中vimentin 和基质金属蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）的表达以促进EMT[54]。Xiong 等[55]通过微阵列评估发现lncRNA HEIRCC 在肾癌组织和细胞中过表达，并与肾癌肿瘤分期、组织学分级、淋巴结转移、远处转移显著相关，HEIRCC 的敲除导致E-cadherin上调以及N-cadherin 和vimentin 下调。此外，对EMT转录因子的分析发现，内源性HEIRCC 表达的缺失明显降低了E-盒结合锌指蛋白1（zinc finger E-box binding protein 1，ZEB1）的数量，而Snail 和Slug 的数量没有显著变化。表明HEIRCC 是一种新的EMT 正性调节因子，在肾癌细胞的EMT 过程中发挥功能。

3 小结与展望

随着RNA 测序技术的进步，越来越多的lncRNA被发现与报道，它们已被证明在癌症的诊断、预后和治疗中具有价值，这为进一步探索它们在癌症中的功能和作用开辟了可能。在人类肾癌组织中及细胞系中，许多致瘤性lncRNA 表达上调，异常lncRNA 表达是肾癌患者预后不良的标志。基于目前的研究，本文总结了一些最新发现的经过实验验证能够调控肾癌发生、发展的lncRNA，重点阐述了这些lncRNA 已确认的功能和机制，包括在调控肾癌细胞增殖、凋亡、细胞周期及介导EMT 方面的潜在作用。然而，由于数量庞大，功能复杂，lncRNA 的研究尚处于初级阶段，大多数lncRNA 的生物学和分子特征仍然未知，lncRNA 在肾癌调控中的机制仍不完全清楚，需要更多的研究来阐明lncRNA 与肾癌的关系，以了解lncRNA 在肾癌中的具体作用和功能。毫无疑问，在未来，随着lncRNA 在肾癌发病机制中的研究逐步深入，其在肾癌诊断、治疗及预后中将发挥出更大的功能。