农村有机生活垃圾干发酵氨胁迫下中试工艺

刘洋，叶小梅，苗晓，王成成，贾昭炎，曹春晖，奚永兰，3

（1 江苏省农业科学院，江苏 南京 210014；2 江苏大学农业工程学院，江苏 镇江 212013；3 农业农村部种养结合重点实验室，江苏 南京 210014；4 徐州市环能生态技术有限公司，江苏 徐州 221000）

我国提出“碳达峰碳中和”（双碳）目标为我国农村生活垃圾处理提出了新的要求。在对农村生活垃圾进行处理时，还需考虑碳排放和碳减排问题，为早日实现“双碳”目标做出贡献。农村生活垃圾是制约我国农村环境改善的重要因素，每年约2.94 亿吨的农村生活垃圾需要处理[1]。厌氧发酵是处理农村生活垃圾有机部分极具潜力的技术[2]，在处理固废的同时生产清洁能源沼气，对碳减排的贡献同样潜力巨大[3]。因此进一步提高厌氧发酵效率，深挖厌氧发酵产甲烷潜力是必要的。

提高厌氧发酵罐内总固体（total solid，TS）含量可以提高池容产气率，降低沼液产出，具有加热能耗低和沼渣后处理容易等优点，因此近年来TS含量较高的干式厌氧发酵技术受到更多关注[4-6]。干式厌氧发酵一般指TS≥20%（样品烘干后重量/样品重量）的厌氧发酵[7]，农村有机生活垃圾的含水率在80%（样品水分重量/样品重量）左右[8]，可直接用于干式厌氧发酵而不需加水调节TS。提高发酵罐内TS 含量会直接导致系统内部挥发性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs）和氨氮快速积累，对产甲烷菌产生严重的抑制，破坏发酵系统平衡[9-12]。本文作者课题组先前的研究表明农村有机生活垃圾厌氧发酵TS含量达到8%已经出现氨氮抑制[13]，TS达到20%时出现严重氨氮抑制[14]。解决氨氮抑制包括接种物驯化、共发酵和氨氮吸附材料等方法，均对高浓度氨氮抑制有显著效果[8,15-16]，其中共发酵是增加农业废弃物厌氧发酵甲烷产量的最常用方法[17]。畜禽粪便作为农业碳排放的主要来源之一，直接对其进行厌氧发酵由于其产沼气潜力低而不具有经济性。其中牛粪具有提高厌氧发酵系统缓冲能力，缓解氨氮抑制的作用[18]，同时其高碳含量可以作为生活垃圾等富氮原料干式厌氧发酵的共发酵底物[19]。因而将农村有机生活垃圾与牛粪进行干式厌氧共发酵的研究是有意义的，可以通过两种原料的性质互补，提高产甲烷效率。同时对农村有机生活垃圾的研究多集中在实验室规模，其工程化应用研究尚少。

本文通过对农村有机生活垃圾和牛粪进行1m3规模的中温干式厌氧共发酵中试试验，考察了农村有机生活垃圾在中试规模下的产甲烷、氨氮、VFAs 和微生物群落的特征，以期获得农村有机生活垃圾氨胁迫下中试规模的发酵特征和潜力，给农村有机生活垃圾沼气工程建设提供技术支持，为农村有机生活垃圾无害化处理和“双碳”目标实现做出贡献。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参考江苏省徐州市沛县大屯街道大王庄生活垃圾分类处置中心的组分[20]，农村有机生活垃圾由江苏省农业科学院食堂的餐厨垃圾尾菜、江苏省农业科学院六合动物科学试验基地的蔬菜秸秆和农作物秸秆粉碎混合而成，混合后采用粉碎机粉碎在-20℃保存。执行试验时至南京优然牧业有限责任公司获取鲜牛粪。农村有机生活垃圾和牛粪的理化性质见表1。接种物取自徐州市环能生态技术有限公司，在发酵罐中使用农村有机生活垃圾37℃±1℃驯化后使用。

表1 底物理化性质

1.2 试验设计

设置发酵罐内TS 质量分数为20%，生活垃圾与牛粪湿重比为3∶1，生活垃圾共进料330kg，牛粪进料110kg，挥发性固体含量（volatile solid，VS）为56.354kg。进料完成后将农村有机生活垃圾、牛粪与接种物搅拌均匀，取样测得发酵罐内TS 质量分数为19.94%。厌氧发酵装置为太阳能厌氧罐系统（徐州市环能生态技术有限公司，徐州），容积为1m3，卧式发酵罐，初始pH 7.5，37℃±1℃中温发酵，发酵周期为130天。发酵装置配置有甲烷含量检测器，实时数据可自动上传至云端，沼气产量采用燃气表计量，通过监控实时传输数据。每10天取样测VFAs浓度和氨氮浓度，在发酵第0 天（B20_1）、第65 天（B20_2）和第130 天（B20_3）取样进行微生物群落分析。

1.3 分析方法

TS 和VS 采用APHA 的方法[21]。试验样品有机碳测定采用稀释热法，全氮测定采用凯氏定氮法[22]。pH 使用pH 计（LAQ UAtwin-pH-22，日本）直接测定。VFAs 由气相色谱仪测定（岛津GC-2014，日本），色谱柱为：DB-FFAP 30m×0.25mm 0.25μm，FID检测器，氮气为载气，进样口温度为250℃，FID温度为300℃，分流比为1∶10，柱箱升温程序为：先在100℃下保持5min，然后以10℃/min速度升到250℃，保持312min，进样量为1μL[13]。氨氮的测定采用氨氮快速测定仪（5B-6D，连华）。微生物群落分析取样时在发酵罐出料口直接出料取发酵混合物，后离心取样品固体部分，采用干冰保温箱寄送至上海美吉生物科技有限公司进行测序系列工作。微生物群落分析包括DNA 抽提、设计合成引物接头、PCR 扩增、构建文库和Ⅰllumina 测序。分析完成后在美吉生物云平台进行分析（https://cloud.majorbio.com）。古菌的引物名称为524F10extF_Arch958RmodR，细菌的引物名称为338F_806R。

2 结果与讨论

2.1 产气量分析

本批次中试试验共进行130天，发酵过程中日沼气产量和累积沼气产量变化如图1所示。发酵系统启动迅速，第2天出现最大峰值。同时由于发酵时间持续较长，发酵过程中出现多次峰值，可能是由于发酵过程中季节跨度较大，环境温度变化导致发酵罐内温度出现波动。本试验采用的接种物为中温发酵所用，因此温度变化可能导致不同时间微生物生命活动水平不同，造成沼气产量的波动。发酵结束时累积沼气产量为70.585m3，单位VS 沼气产量达到了1.253m3/kg，其沼气产率远超实验室小试的最大值（0.509m3/kg和0.633m3/kg）[2,8]。

图2为农村有机生活垃圾干式厌氧共发酵过程中甲烷含量及甲烷产量变化。甲烷含量的高低可以直观判断厌氧发酵系统运行状况[23]，一般认为甲烷体积分数大于50%发酵系统处于正常运行状态[23-24]。发酵开始后甲烷含量迅速上升，随后维持在70%小幅度波动。发酵第63 天甲烷含量出现了降低，在57%稳定3天后又上升至70%左右。此次波动与该时间段内气温降低有关，较低的气温影响太阳能系统传热效率，需要更长的时间维持发酵罐内温度，造成罐内温度较低。高甲烷含量可能与发酵过程中较高的氨氮浓度有关，在未达到氨氮抑制浓度之前，更高的氨氮浓度会导致更高的甲烷含量[7]。发酵结束时单位VS 甲烷产量达到了0.815m3/kg，对 比 已 有 文 献[25-26]报 道（0.490～0.737m3/kg、0.633m3/kg）的生活垃圾均处于领先水平。这与本次中试试验采用的厌氧发酵设备有关，发酵罐为卧式厌氧发酵罐，罐内的搅拌装置可以提供更加充分的搅拌效果，增强发酵罐内传质效率，最终提高甲烷产量。

2.2 氨氮浓度变化分析

氨氮可用作细胞生长所需氮源，但过多的氨氮在发酵过程中积累会对甲烷合成产生抑制作用[27-29]。分析农村有机生活垃圾干式厌氧共发酵过程中氨氮浓度变化，结合甲烷产生情况可以判断发酵系统的稳定性。图3为厌氧发酵过程中氨氮浓度变化。发酵过程氨氮浓度整体在4200～5200mg/L范围内变化，氨氮浓度显著高于已有报道厌氧发酵过程中的抑制阈值[30-31]。

图3 氨氮浓度变化

而稳定于70%的甲烷含量和累积0.815m3/kg的甲烷产量说明发酵系统在高效运行，该氨氮浓度并未对系统产生抑制作用。本试验发酵系统始终处于较高的氨氮环境中，其甲烷产量说明系统是具有高氨氮耐受能力的，产甲烷菌没有因为高氨氮浓度而大量死亡，这可能与本次发酵所采用的优质接种物有关。接种物使用农村有机生活垃圾进行驯化后具有较强的氨氮耐受能力，较高的氨氮浓度为细菌生命活动提供充足的氮源，使得产甲烷菌始终保持较高的活性和数量，为生产甲烷提供坚实的基础。

2.3 VFAs浓度变化分析

VFAs主要在厌氧发酵过程水解酸化阶段产生，水解酸化阶段产生更多的VFAs 说明对发酵底物的分解更加彻底，当VFAs 浓度超过发酵系统阈值后发酵系统失衡，产甲烷菌活性被抑制，系统发生酸化[32]。图4为农村有机生活垃圾干式厌氧共发酵过程中的VFAs浓度变化。图中可以看出，发酵前10天VFAs 浓度处于上升阶段，发酵主要处于快速水解和酸化阶段，大量的有机物被细菌降解为VFAs。高浓度的VFAs 往往伴随着酸化，本次试验中甲烷含量和产量都处于较高的范围内变化表明该浓度的VFAs并未对产甲烷菌产生胁迫作用。较高的VFAs浓度也说明对农村有机生活垃圾含有的难降解的纤维素类物质可能得到了更充分的降解，最终提高甲烷产量。达到峰值后VFAs 浓度开始下降，甲烷含量也快速趋于稳定，表明产甲烷菌在正常工作，将利用大量的VFAs生产甲烷。

图4 VFAs浓度变化

2.4 微生物群落变化

厌氧发酵过程中3 个阶段分别由特定的水解菌、产酸菌和产甲烷菌群介导，如果3个阶段失衡则会出现严重的酸化和氨氮抑制等问题，最终导致无法正常产甲烷[33-34]。农村有机生活垃圾干式厌氧共发酵中试各阶段微生物群落组成变化如图5所示。

图5 微生物群落结构变化

古菌在属水平上的群落结构显示，干式厌氧发酵过程中甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）的相对丰度远高于其他菌属，在发酵的3个阶段其相对丰度均超过80%。启动阶段Methanosarcina的绝对优势地位说明驯化的接种物具有良好的产甲烷微生物环境，且为驯化过程中成长起来的适宜进行农村有机生活垃圾厌氧发酵的菌。运行阶段和试验结束时相对丰度仍超过80%，说明驯化的接种物完美适配农村有机生活垃圾干式厌氧共发酵中试。

细菌的门分类水平显示厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度3个阶段均超过77%，最高为启动阶段的85.39%，试验结束时为83.58%。发酵过程中出现了轻微波动，但在发酵系统中仍处于绝对优势地位，可以保证有充足的细菌环境将有机物代谢成酸，供产甲烷菌利用生产甲烷。拟杆菌门（Bacteroidota）从启动阶段的3.87%增长至运行阶段的13.44%，发酵过程中Firmicutes 相对丰度的轻微降低与Bacteroidota 的增长有关。Bacteroidota 可以分泌多种细胞外水解酶，将葡萄糖、淀粉等转化为乙酸、丁酸、H2和CO2等[35]，同样利于水解酸化阶段的充分进行。

2.5 韦恩图分析

韦恩图可以直观对比中试试验过程中不同阶段共有物种和独有物种，古菌和细菌在OTU 水平的韦恩图分别如图6 所示。3 个时间段的古菌在OTU水平上有87.50%的菌是共有的，表明古菌在发酵过程中保持较高的相似性，较高的相似性表明发酵系统比较稳定，驯化的接种物发挥作用。启动阶段和运行阶段有1种菌共有，试验结束时有2种菌独有。这表明发酵前后微生物群落结构稳定，没有其他杂菌生长影响与产甲烷菌形成竞争关系，为厌氧发酵的高效进行提供保障。细菌在OTU水平3个阶段共有核心物种占51.57%，相似性较古菌降低，这是由于在该水平下细菌物种较多，3个阶段均超过了800，更多的物种带来更多的差异性。古菌的多样性则较低，3个阶段为22～23。这可能是在高氨环境下造成的，能正常进行生命活动的古菌种类较少，但其适应了高氨环境，可以正常生产甲烷。发酵过程中3个阶段的菌种类较接近，表明厌氧发酵系统内细菌群落稳定，厌氧发酵各阶段功能菌群在适宜的环境发挥作用。

图6 古菌和细菌在OTU水平韦恩图

微生物群落分析表明，农村有机生活垃圾干式厌氧共发酵中试试验中水解、酸化和产甲烷阶段都有优势菌存在，生长情况良好，Methanosarcina和Firmicutes 分别为古菌和细菌的绝对优势菌。这为发酵生产甲烷提供了极佳的微生物环境，实现单位VS累积甲烷产量远高于已有报道。

综上，农村有机生活垃圾干式厌氧发酵中试试验过程中产气情况、VFAs 浓度、氨氮浓度和微生物变化情况表明，此次发酵试验成功进行。发酵系统内部氨氮浓度处于高值，高于一般文献所报道的产生抑制作用的阈值。在高氨环境中，发酵系统的甲烷体积分数在70%作用，且累积甲烷产量达到了新的高度。说明此次干式厌氧发酵试验方案设计合理，通过共发酵，专用接种物驯化和传质效率较高的太阳能发酵罐共同作用，使得发酵系统内微生物比较契合农村有机生活垃圾等高有机质含量原料。共发酵使得发酵系统具有更高的缓冲能力；接种物驯化使得细菌保障水解更彻底，为产甲烷提供更充分底物，产甲烷古菌具有更高的耐氨能力，在高氨环境中保持生命活动，持续利用前阶段底物生产甲烷；传质效率更高的发酵罐搅拌更充分，保证发酵底物与微生物接触更加充分，防止局部酸化。以上方式共同保障发酵系统平稳运行。同时此次中试试验持续130天，充分挖掘了农村有机生活垃圾的产气潜力，这也解释了其最终产气量领先于已有研究。

3 结论

对农村有机生活垃圾进行了干式厌氧共发酵中试试验，累积甲烷产量达到了0.815m3/kg，相较于已有文献报道处于领先水平。发酵过程VFAs 浓度呈现先增长后降低的趋势，氨氮浓度变化稳定，未出现酸化和氨氮抑制现象。微生物群落结构分析表明此次干式厌氧发酵中试系统的微生物生长环境良好，Methanosarcina和Firmicutes分别为古菌和细菌的绝对优势菌群，发酵各阶段达到了平衡。甲烷产量较高中试规模的干式厌氧发酵试验为农村有机生活垃圾沼气工程建设提供了有效的数据支持。