甘草多糖对断奶仔猪生长性能和生长基因表达量的影响

杨又兵 李新月 娄然 刘永建 任旭鸽 曾凡林 游祥宾 李淦 徐志谦 雷莹 白俊艳

摘要：选取甘草多糖（GPS）为原料，主要研究甘草多糖对断奶仔猪生长性能、血清免疫指标和生长基因表达量的影响。结果表明，在对断奶仔猪生长性能影响中，800、1 500 mg/kg GPS处理组的ADG与对照组相比，差异显著；在对断奶仔猪腹泻率影响中，400、800、1 000 mg/kg GPS处理组和对照组相比，腹泻率显著下降；在对断奶仔猪血清免疫球蛋白中，1 000、15 000 g/kg GPS处理组与对照组相比，血清中IgG含量显著升高，800、1 500 mg/kg GPS处理组与对照组相比，血清中IgM含量显著升高；在断奶仔猪生长基因表达量中，肝脏中800 mg/kg GPS处理组的IGF-1基因mRNA表达量与对照组相比显著升高，背长肌中1 000 mg/kg GPS处理组的IGF-1基因mRNA表达量与对照组相比显著升高，800 mg/kg GPS处理组IGF-2基因的mRNA表达量与对照组相比显著升高（P<0.05）。

关键词：甘草多糖；生长性能；cDNA；基因表达量；断奶仔猪

中图分类号：S816.7  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）13-0182-07

甘草，或称光果甘草，是中药中“必不可少的草药”。甘草在我国的使用早于希腊和罗马帝国，有着悠久的传统药物和民间疗法历史［1］。甘草原产于南欧和亚洲部分地区，它被广泛用作草药和天然甜味剂。甘草被认为是最重要的6种草药之一，并且在联合应用时可以降低某些草药的毒性并提高其疗效，有一个经典的中医理论称“五方十有八九含甘草”［2］。在临床方面甘草也是一种重要中药，它含有20多种三萜类化合物和300多种黄酮类化合物［3］。甘草可以用于治疗多种疾病，如呼吸系统疾病、癫痫、发热、性衰弱、瘫痪、胃溃疡、风湿、皮肤病、出血性疾病、黄疸等，这与甘草自身的活性和药理作用有很大的联系［4］。和甘草相关的衍生物包括甘草酸、甘草次酸、甘草皂苷和甘草黄酮类中的甘草总黄酮、异甘草素、甘草苷、光甘草定、甘草多糖等，这些甘草衍生物都是近些年发现的从甘草中提取的活性成分［5-6］。

甘草多糖（glycyrrhiza polysaccharide，GPS）是一种酸性吡喃多糖，内部有小气泡状孔洞。相关研究表明，GPS因能增强免疫调节和抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗过敏、抗炎等重要生物活性而备受重视。GPS具有毒性小、易提取等优势，在动物产品上也可用做饲料添加剂，能够显著加强畜禽免疫调节功能，提高生长性能，有着广泛的应用前景。本试验主要研究了GPS作为饲料添加剂对断奶仔猪生长性能和免疫等方面指标的影响，旨在为健康养殖和畜牧业发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

甘草多糖原料购自河南省洛阳蓝斯利科技有限公司，饲料购自河南省洛阳市六和饲料有限责任公司。试验选用60头 健康、初始体质量为（8.33±0.39）kg/头的28日龄的杜洛克×长白×大白 三元杂交猪，公母各半。试验于2021年5—7月在河南省新郑市银发牧业猪场进行。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集 采取单因素设计，随机分为5个处理组，每个处理组包括3个重复，每个重复（栏）4头仔猪。预试期3 d，正试期28 d。试验组分别饲喂添加400、800、1 200、1 500 mg/kg GPS的试验日粮，对照组饲喂基础日粮。在每个重复中选取1头健康状况良好的断奶仔猪，空腹时进行前腔静脉采血 10 mL，并加入ACD抗凝血剂（ACD与血液的体积比为1 ∶5），将采集完成的血样放置在冰盒中，用记号笔编号，带回实验室进行离心并收集血清，用于后续的指标测定。断奶仔猪放血后进行屠宰，以组为单位，采集每个重复1头断奶仔猪的肝脏和背最长肌组织，并用无菌手术剪剪成小块（约1 cm3），放入冻存管中，用记号笔标注编号，随即装入液氮中，带回实验室保存待测。

1.2.2 生长性能指标测定 仔猪日采食量（average daily feed intake，ADFI）：每天早晨在投料前对仔猪逐个称质量，并对前1 d仔猪所吃剩的料进行称质量，统计各组仔猪采食量，计算每头猪平均日采食量。仔猪平均日增质量（average daily gain，ADG）：以每个组重复为单位，在试验开始进行至结束每天07：00对仔猪进行空腹称质量，并计算平均日增质量。料肉比F/G（Feed/Gain）＝ADFI /ADG。

1.2.3 腹泻率测定 每天观察猪的健康状况，记录各栏猪的腹泻次数，计算各处理组的腹泻率。

腹泻率＝（腹泻猪头数×猪腹泻天数）/（试验猪头数×试验天数）×100％

1.2.4 血清免疫指标测定 使用南京建成试剂盒，具体型号为免疫球蛋白IgA测定试剂盒E027-1-1、免疫球蛋白IgM测定试剂盒E025-1-1、免疫球蛋白IgG测定试剂盒H106-1-1，分别测定血清的IgA、IgG、IgM含量，并按照试剂盒中步骤进行操作。

1.2.5 引物设计 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具体引物信息见表1。

1.2.6 组织样RNA提取、检测 （1）从冻存管里取大约100 mg的组织样品，采用液氮充分碾磨后，用提前預冷的小勺把组织转入1.5 mL的RNase-free离心管中加入1 000 μL的RNAiso Plus（trizol）进行匀浆，室温静置5 min，10 000 g 4 ℃离心6 min。（2）取上清到新的1.5 mL的RNase-free离心管中，加入200 μL的三氯甲烷并振荡15 s，放置 10 min，期间不断摇晃，然后离心10 min。（3）取上清到新的1.5 mL的RNase-free离心管中，加入500 μL异丙醇，室温放置10 min，10 000 g离心 10 min，离心后底部管壁会产生白色RNA沉淀。（4）弃上清，保留白色沉淀物，加1 mL 75%乙醇，然后把离心管放入4 ℃、7 500 g的离心机内离心 5 min，弃上清，再次离心1 min，打开盖子晾干 5 min，乙醇易挥发，可以将离心管中的残留液体挥发带走。（5）往晾干的离心管内加入20 μL DEPC水，用枪头吹打混匀。（6）用超微量分光光度计检测，检测D260 nm/D280 nm值在1.8～2.0之间，表明RNA纯度较高，可以用于后续反转录和荧光定量试验。

1.2.7 cDNA合成 试验使用TaKaRa反转录试剂盒合成cDNA。反转录的体系（1）共10 μL，具体配制见表2。将体系（1）各分部试剂混合均匀后，放入PCR仪中，并按说明书程序进行设置，来进行反转录反应，具体设置为42 ℃ 2 min，4 ℃冷却。反转录体系（2）共20 μL，具体配制见表3。混匀体系（2）各部分试剂，按说明书进行反转录反应，设置为 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃冷却。上述试操作都在冰盒上进行，合成的cDNA储存于－20 ℃。

1.2.8 实时荧光定量PCR 试验使用TaKaRa试剂盒，反转录的体系共20 μL，具体配制见表4。

1.2.9 数据处理 生产数据采用SPSS 25.0进行单因素方差分析，并用Duncan s法进行多重比较检验，结果以平均数±标准差表示。相对定量数据采用Excel 2010对数据进行整理，用2-ΔΔCT法进行计算。试验结果进行t检验分析其显著性，使用GraphPad Prism 8.0.1进行作图。*代表差异显著（P<0.05）；**代表差异极显著（P<0.01）。

2 结果与分析

2.1 甘草多糖对断奶仔猪生长性能的影响

由表5可知，400、800、1 000、1 500 mg/kg GPS处理组与对照组相比，始质量、末质量、ADFI、F/G没有显著差异，但ADFI、ADG相比对照组有所升高；800、1 500 mg/kg GPS处理组的ADG与对照组相比，差异显著（P<0.05）。

2.2 甘草多糖对断奶仔猪腹泻率的影响

由表6可知，400、800、1 000 mg/kg GPS处理组的腹泻率和对照组相比，显著下降（P<0.05）。1 500 mg/kg GPS处理组也可以使腹泻率降低，但差异不显著。

2.3 甘草多糖对断奶仔猪血清免疫球蛋白的影响

由表7可知，试验各组血清中IgA含量没有显著差异；1 000、1 500 g/kg GPS处理组与对照组相比，血清中IgG含量显著升高（P<0.05）；800、1 500 mg/kg GPS处理组与对照组相比，血清中IgM含量显著升高（P<0.05）。

2.4 甘草多糖对断奶仔猪生长基因表达量的影响

由图1可知，在肝脏中，GPS处理组和对照组相比，GHR基因和IGF-2基因的mRNA表达量差异不显著；800 mg/kg GPS处理组的IGF-1基因的mRNA表达量与对照组相比，显著升高（P<0.05）；其余各处理组IGF-1基因的mRNA表达量与对照组相比，差异不显著。

由图2可知，在背长肌中，与对照组相比，GPS处理组GHR基因的mRNA表达量差异不显著；1 000 mg/kg GPS处理组的IGF-1基因的mRNA表达量显著升高（P<0.05）；其余各处理组的IGF-1基因mRNA表达量差异不显著。800 mg/kg GPS处理组IGF-2基因的mRNA表达量与对照组相比显著升高（P<0.05），其余各处理组IGF-2基因的mRNA表达量与对照组相比差异不显著。

3 讨论

3.1 甘草多糖对断奶仔猪生长性能的影响

自1943年首次将多糖用作药物以来，随着生物化学的发展以及各种分离技术的研究和应用，多糖的复杂结构和多样性逐渐被人们所认识［7］。植物多糖对动物机体有诸多有益功效，能够改善畜禽的生长性能，提升动物机体的抗病能力，并且增进机体对营养物质的消化吸收和利用等［8-9］。在基础日粮中添加一定剂量的多糖可以提高仔猪ADFI、ADG，并降低F/G。Zhao等研究发现，添加桑叶多糖饲喂断奶仔猪，在低（0.3 g/kg）、中（0.6 g/kg）、高（0.9 g/kg）剂量组中的ADFI均高于对照组［10］。另有研究表明，在饲粮中添加酵母壁多糖和黄芪多糖、刺五加皂苷混合物，可以增高断奶仔猪的ADG、ADFI，并且有减弱F/G的趋势［11-12］。本试验结果表明，日粮中添加800、1 500 mg/kg的GPS可以显著提高断奶仔猪的ADG，而其余指标与各处理组之间没有明显差别，但添加GPS各剂量组的ADFI均高于对照组。据前人研究，在断奶仔猪饲粮中加入太子参茎叶多糖和白术多糖，可以使断奶仔猪的ADG增加；添加白术多糖还可以降低F/G［13-14］，本试验结果与之相似。本试验各处理组GPS增加了断奶仔猪的ADFI，显著增加了ADG，并且在高剂量组中数值最大，生长性能基本呈剂量依赖性关系。总体而言，GPS有助于改善饲料的适口性和增加饲料的消化吸收率，提高断奶仔猪的生长性能。

3.2 甘草多糖对断奶仔猪腹泻率的影响

断奶是仔猪生活中营养方式与生存环境改变的转折点。仔猪腹泻目前仍是养猪业需要关注的重点问题，防控不到位会造成巨大损失；伴随着胃肠结构、肠道功能和免疫系统的明显变化，断奶后仔猪肠道疾病和腹泻的发病率较高，生长迟缓［15-16］。在實际生产过程中，还可能由于一些致病菌的侵入，导致猪的机体出现腹泻等症状。多糖对降低断奶仔猪的腹泻率有良好的作用效果，在断奶仔猪饲粮中单独添加黄芪多糖、白术多糖和牛膝多糖，可以明显改善断奶仔猪发生腹泻的情况，3种多糖类添加剂联合使用也有较好的功效［17］。刘佳等在饲粮中添加酵母多糖，可以抑制断奶仔猪发生腹泻的情况，添加0.2%酵母多糖作用效果最好［18］。另有研究发现，白术多糖与上述多糖作用效果类似，并且仔猪在14～28日龄时，添加 9 g/kg 白术多糖腹泻率最低［19］。本试验结果显示，添加400、800、1 000 mg/kg GPS，可以明显控制断奶仔猪腹泻情况的发生，与其他多糖类饲养试验结果相同；添加 400 mg/kg GPS时，仔猪腹泻率最低，随着GPS剂量的增加，仔猪腹泻率有所升高，这可能是由断奶仔猪胃肠消化及吸收能力的下降而引起；但相比于对照组，GPS处理组的腹泻率显著性减少。本试验说明，在饲粮中添加GPS可以改善仔猪的腹泻率，在添加剂量为400 mg/kg时，效果最佳。

3.3 甘草多糖对断奶仔猪血清中免疫球蛋白的影响

近年来，随着畜牧业绿色健康养殖的发展，人们对营养调控和免疫的联系更加关注。许多研究表明，良好的营养条件可以增强动物机体的免疫防御能力，促进机体的免疫活动［20］。免疫球蛋白是一种由抗原刺激动物体内产生的球蛋白，它具有结合抗原、刺激补体产生等生物学功能，普遍存在于血液、组织液和外分泌液中［21］。其中，IgA、IgG、IgM普遍存在于各种哺乳动物的血清中，形成反映机体体液免疫的主要指标。因此，在断奶仔猪阶段，IgA、IgG、IgM含量的提高可以在一定程度上减少疾病的发生［22］。科学研究已证实，众多植物多糖可产生免疫调控作用，是天然的免疫调节剂，并能够活化T、B淋巴细胞，提高动物机体血清中的抗体水平，增强免疫调节［23］。有研究称，在日粮中添加高剂量浓度（0.08%）的决明子多糖，能够使血清中IgA、IgM、IgG的含量明显提高［24］。Chen等在断奶仔猪日粮中添加1 000、1 500 mg/kg牛膝多糖，仔猪在第14天和第28天的血清中IgG、IgA、IgM含量明显增多［25］。本试验结果表明，添加800、1 500 mg/kg GPS，可以使仔豬血清中IgM含量显著升高；添加 1 000、1 500 mg/kg GPS，可以使仔猪血清中IgG含量显著升高。胡菁等研究发现，GPS可以增加小鼠血清中IgG、IgM浓度，在600 mg/kg浓度时有显著性的增加，从而增强机体的体液免疫［26］，本试验研究结论与之一致。表明GPS能够增加血清中免疫球蛋白浓度，提高动物机体的体液免疫。

3.4 甘草多糖对断奶仔猪生长基因表达量的影响

生长激素受体（GHR）基因与GH基因有很高的关联度，GHR可以调控GH基因的表达，也是生长轴的重要组成部分，被认为是产后体细胞生长的主要调节因子，在刺激细胞分裂、骨骼生长、蛋白质合成等过程中有所影响，在动物的生长发育中起着重要作用［27-28］。GH发挥作用的前提需要与GHR结合；如果GHR不足，GH发挥作用也会受到抑制。以往认为GHR仅在鱼类和哺乳动物的肝脏中表达，介导IGF1的释放以响应GH结合；另有数据表明，GHR也在外周组织中表达，局部调节GH的促生长作用［29］。不同的营养水平下，不同物种GHR基因的mRNA表达量也有所不同。有研究表明，在饲粮中添加复方中药制剂，能够提高仔猪胸腺、脾脏GHR基因的mRNA表达量［30］。Kareem等研究发现，在饲料中添加益生元和菊糖，对肉鸡肝脏中GHR基因的mRNA表达量有所升高［31］。本试验结果发现，添加不同剂量的GPS，肌肉中GHR基因的mRNA表达量与对照组相比没有显著差异，但添加GPS后各组的表达水平有所提高；在添加 800 mg/kg 剂量GPS时，GHR基因的mRNA表达量最高。Gasparino等发现，在高饲料效率（FE）肉鹌鹑肝脏和肌肉中IGF-1的mRNA表达量较高，肌肉中GHR基因mRNA表达量较高［32］。饲喂玉米须粉和非淀粉多糖酶提高了仔猪的生长激素受体（GHR）和胰岛素生长因子（IGF）的mRNA相对表达量［33］。但本试验中，肝脏和背最长肌中，各剂量组和对照组相比，GHR基因的mRNA表达量没有显著性的提高，但800、1 000 mg/kg GPS处理组与对照组相比，GHR基因的mRNA表达量有升高趋势，这表明添加适当浓度的GPS对动物机体GHR基因的表达有上调作用。综上所述，在添加 800 mg/kg 剂量的GPS时，GHR基因表达量最高，效果最佳。

IGF-1可以通过调节生长激素的多种作用，参与发育、生长、生殖、代谢相关的关键生物学功能［34-36］。安静等分离培养绵羊原代成肌细胞，用重组慢病毒感染细胞等过程绘制细胞生长曲线，发现IGF-1能够促进绵羊成肌细胞的增殖［37］。同时，IGF-1也能够促进兔脂肪干细胞的生长和成骨分化，并且呈量效依赖性关系［38］。以上研究说明，IGF-1 最典型的功能之一是促生长作用，可以促进细胞的增殖和分化，进而来调节细胞的有丝分裂。本试验研究表明，添加800 mg/kg GPS后，肝脏中IGF-1基因mRNA表达量与对照组相比显著升高；添加1 000 mg/kg的GPS后，背最长肌中IGF-1基因的mRNA表达量与对照组相比显著升高。有研究称，在断奶仔猪饲粮中添加桑叶多糖，肝脏和背最长肌组织中IGF-1基因的mRNA表达水平都有了明显提高，低剂量组的背最长肌中IGF-1基因的mRNA表达量显著高于抗生素组，本试验结果与之相似；通过试验发现IGF-1基因mRNA表达量总体呈量效依赖性关系，在表达量达到最高后相对下降［39］。文贵辉等利用白术多糖饲喂樱桃谷鸭发现，白术多糖可以提高樱桃谷鸭肌肉中IGF-1基因的表达量［40］。本试验结果表明，GPS有一定的促生长作用，可能是由于GPS可以促进组织中 IGF-1 基因的mRNA表达量，进而提高细胞的增殖和分裂，促进动物的生长发育，但其具体机制还需要进一步验证。

IGF-2是一种小分子单链结构的肽类物质（分子量7 471 u，67个氨基酸残基），在胎儿发育和产后生长发育中起着主要作用，因此也称为胚胎样生长因子［41］，在猪体内位于2号染色体上。研究表明IGF-2对牛骨骼肌卫星细胞的生长具有促进作用［42］。郭玉姣等利用荧光定量PCR技术，在长白猪和太湖猪身上发现IGF-2与早期脂肪细胞的增殖分化有关［43］。以上结果说明IGF-2在肌肉生长和分化过程中和脂肪性状方面也扮演着重要的作用。IGF-2基因在不同猪种不同组织中的表达量也有些许差异，朱晓峰等表明IGF-2基因在从江香猪肝脏和肺脏中的表达量最高，而在大白猪背最长肌和心脏的表达量均超过其他组织［44］。本研究结果表明，在肝脏中，各剂量组与对照组相比，IGF-2基因的mRNA表达量差异不显著。在背长肌中，添加800 mg/kg GPS，IGF-2基因mRNA表达量显著升高；在添加剂量为800 mg/kg时，IGF-2基因的表达量最高，在此浓度基础上增加剂量而表达量逐渐降低。而张冰等研究发现，IGF-2基因对猪的平均日增质量影响显著，与前面结果发现添加800、1 500 mg/kg  GPS对断奶仔猪平均日增质量影响有显著差异结果相似，说明不同剂量的GPS可以调节IGF-2基因的表达，可能是由于IGF-2促进机体的骨骼肌细胞增殖分裂，提高了断奶仔猪的生长发育［45］。

4 结论

日粮中添加不同剂量的GPS能够增加断奶仔猪的日采食量，添加800、1 500 mg/kg浓度的GPS能够明显增加断奶仔猪的平均日增质量，400、800 mg/kg 低剂量组可以降低料肉比，但差异不明显。说明GPS在一定程度上可以提高断奶仔猪的生长性能，添加剂量在800 mg/kg时，效果最佳。日粮中添加400、800、1 500 mg/kg GPS，能显著降低断奶仔猪的腹泻率，添加400 mg/kg GPS效果最佳。日粮中添加1 000、1 500 mg/kg GPS对IgG含量有显著性提高；添加800、1 500 mg/kg GPS对IgM含量有显著性提高，但各试验组之间IgA含量没有显著差异。日粮中添加GPS在一定程度上可以上调GHR、IGF-1、IGF-2基因mRNA的表达量并有一定的显著性关系，对提高动物生长性能具有正向调控作用。

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