富马酸二甲酯对亚砷酸钠诱发小鼠胰岛MIN6细胞氧化应激损伤的保护作用*

赵紫汐 王司琪 李雪研，3 徐春雪 赵 曦 杨 蓓△

（中国医科大学，1 基础医学院组织学与胚胎学教研室，2 2019级临床医学专业，3 2017级基础医学专业，沈阳 110122）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）发病原因主要有2 个方面，胰岛β 细胞损伤和胰岛素抵抗，其中β 细胞损伤是2 型糖尿病发病的决定因素，因此研究保护和恢复胰岛β 细胞结构与功能成为防治2 型糖尿病的关键。氧化应激是2 型糖尿病胰岛β 细胞损伤的致病机制之一。Nrf2/ARE 途径是细胞内抗氧化反应的重要的信号通路。课题组前期研究表明，砷暴露能够诱导胰岛β 细胞内核因子E2 相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/ARE 信号通路活化，抵御急性氧化应激损伤。富马酸二甲酯（dimethyl fumarate，DMF，商品名为Tecfidera），是一款可以口服治疗多发性硬化症的新药。近年来研究表明DMF 除多发性硬化症以外，还对多种疾病具有治疗潜力。DMF 是Nrf2 激动剂，因此本研究以小鼠胰岛β 细胞株MIN6 为研究对象，探讨DMF 在亚砷酸钠诱发的氧化应激损伤中的作用及相关机制，旨为砷致2 型糖尿病的预防与治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

小鼠胰岛β 细胞株MIN6 由中国医科大学公共卫生学院赠送。DMEM、青霉素、链霉素、胰蛋白酶（Invitrogen 公司）；胎牛血清（Procell 公司），β-巯基乙醇、DMF、亚砷酸钠、二甲基亚砜、Triton X-100、多聚甲醛、TRIzol（Sigma 公司）；MTT 试剂盒（Promega 公司）；ROS 检测试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、含DAPI 封片剂（碧云天公司）；BCA 蛋白浓度检测试剂盒（Thermo 公司）；Nrf2 抗体、GAPDH 抗体（Santa Cruz 公司）；山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗（武汉三鹰公司）；Alexa Fluor 594 标记的驴抗兔二抗（Invitrogen 公司）；反转录与实时荧光定量PCR 试剂盒（TaKaRa公司）。

1.2 细胞培养、分组与染毒

将MIN6 细胞接种于培养瓶，采用含5 μL/L β-巯基乙醇、15 %胎牛血清、50 μg/mL 青链霉素的高糖DMEM 培养基，于5 % CO2、37 ℃培养箱中培养。根据DMF 最适处理浓度筛选结果，将MIN6 细胞随机分为4 组：正常对照组、4 μmol/L NaAsO2组、25 μmol/L DMF 预处理+4 μmol/L NaAsO2组、50 μmol/L DMF 预处理+ 4 μmol/L NaAsO2组。

1.3 MTT 法测定细胞活性

将MIN6 细胞接种于96 孔板内，于5% CO2、37 ℃培养箱内24 h 后，按细胞分组进行染毒处理，其中25、50 μmol/L DMF 预处理时间为6 h，4 μmol/L NaAsO2处理时间为24 h，然后加入含MTT液的无血清培养基，避光孵育3 h，弃上清，加入二甲基亚砜，经酶标仪测定OD 值，波长为490 nm。

1.4 TUNEL 荧光染色法测定细胞凋亡

将MIN6 细胞接种于6 孔板中的盖玻片上，5%CO2、37 ℃培养箱内24 h 后，按细胞分组进行染毒处理，其中25、50 μmol/L DMF 预处理时间为6 h，4 μmol/L NaAsO2处理时间为24 h，使用4 %多聚甲醛1 h，再加入0.2 % Triton X-100 处理5 min，H2O2封闭10 min，PBS 漂洗，滴加50 μL TUNEL反应缓冲液，避光孵育1 h，含DAPI 封片剂封片，激光共聚焦扫描显微镜下观察，并拍照，以TUNEL 反应阳性细胞与总细胞的比率计算细胞凋亡率。

1.5 DCFH-DA 荧光探针法测定细胞内ROS 水平

将MIN6 细胞接种于6 孔板中的盖玻片上，5 %CO2、37 ℃培养箱内24 h 后，按细胞分组进行染毒处理，其中25、50 μmol/L DMF 预处理时间为6 h，4 μmol/L NaAsO2处理时间为6 h，加入终浓度为10 μmol/L DCFH-DA，避光孵育30 min，激光共聚焦扫描显微镜下观察及照相，Image J 软件分析荧光强度代表细胞内ROS 水平。

1.6 免疫细胞荧光法观察细胞内Nrf2 定位表达

将MIN6 细胞接种于6 孔板中的盖玻片上，培养箱内培养24 h，按细胞分组进行染毒处理，其中25、50 μmol/L DMF 预处理时间为6 h，4 μmol/L NaAsO2处理时间为6 h，4 %多聚甲醛固定1 h，0.2%Triton X-100 处理5 min，PBS 漂洗3 次，兔抗小鼠Nrf2 一抗（1∶500）4 ℃ 孵育过夜，Alexa Fluor 594 标记的驴抗兔二抗（1∶1 000）避光孵育1 h，洗涤，含DAPI 封片剂封片，激光共聚焦扫描显微镜下观察，并拍照。

1.7 免疫印迹测定细胞内Nrf2 蛋白表达水平

将MIN6 细胞按细胞分组进行染毒处理，其中25、50 μmol/L DMF 预处理时间为6 h，4 μmol/L NaAsO2处理时间为6 h 后，胰蛋白酶消化后收集、裂解、离心、提取上清液。BCA 方法测定蛋白浓度。电泳、转膜、封闭，加入一抗：Nrf2（1∶500）、GAPDH（1∶1 000），4℃ 过夜，山羊抗兔二抗（1∶1 000）、山羊抗小鼠（1∶1000）二抗孵育，发光显色，使用Image J 软件对蛋白条带灰度值进行分析，以Nrf2 与内参GAPDH 的蛋白条带平均灰度值的比值表示Nrf2 蛋白相对表达量，进行半定量分析。

1.8 Real-time RT-PCR 测定目的基因mRNA 表达水平

按细胞分组进行染毒处理，其中25、50 μmol/L DMF 预处理时间为6 h，4 μmol/L NaAsO2处理时间为6 h，每组细胞加入1 mL TRIzol 试剂与200 μL的三氯甲烷，离心后提取上清液加入同体积的异丙醇，再次离心后使用得到RNA 沉淀，使用75%乙醇溶液清洗3 遍后加入DEPC 水溶解得到细胞总RNA。使用TaKaRa 公司的逆转录试剂盒与实时荧光定量试剂盒合成cDNA，并进行实时荧光定量PCR 检测，采用 β-actin 作为内参对照，最终以2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。Nrf2 上游引物序列为5′-CCCATTTGTAGATGACCATGAG-3′，下游引物序列为5′-CCATGTCCTGCTCTATGCTG-3′；Ho-1 上游引物序列为5′-ACAGAGGAACACAAAG ACCAG-3′，下游引物序列为5′-GTGTCTGGGAT GAGCTAGTG -3′；Trx1 上游引物序列为5′-GCTTG TCGTGGTGGACTTCTCTG-3′，下游引物序列为5′-CAGCAACATCCTGGCAGTCATCC-3′；Gclc 上游引物序列为5′- ACCATCACTTCATTCCCCAG-3′，下游引物序列为5′-TTCTTGTTAGAGTACCGAA GCG-3′；Gclm 上游引物序列为5′-AATCAGCCCCG ATTTAGTCAG-3′，下游引物序列为5′-CGATCCTA CAATGAACAGTTTTGC-3′；β-actin 上游引物序列为5′-TCCTTCCTGGGCATGGAG-3′，β-actin 下游引物序列为5′-AGGAGGAGCAATGATCTTGATC TT-3′。

1.9 统计学处理

应用统计软件Graphpad Prism 8 进行结果分析。多组间单个变量比较应用单因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MIN6 细胞活性比较

应用10、25、50、100、200、400 μmol/L DMF处理MIN6 细胞24 h，与正常对照组比较，10、25、50 μmol/L DMF 处理对细胞活性未见明显影响（图1A）。故后续实验选择25 μmol/L 和50 μmol/L作为后续实验中DMF 的预处理浓度。

图1 MIN6 细胞活性

应用25、50 μmol/L DMF 预处理MIN6 细胞6 h，再经4 μmol/L NaAsO2处理24 h。MTT 结果显示，与NaAsO2组比较，DMF 预处理可以显著提升MIN6 细胞的活性，且存在明显的剂量-反应关系，差异有统计学意义（图1B）。

2.2 MIN6 细胞凋亡水平比较

与正常对照组比较，NaAsO2组中绿色凋亡荧光信号数量显著增多，并与蓝色DAPI 荧光共定位于细胞核，融合为蓝绿色荧光；经25、50 μmol/L DMF 预处理干预后，可以显著减少绿色凋亡荧光信号数量，且存在明显的剂量-反应关系，差异有统计学意义（图2A、2B）。

图2 MIN6 细胞凋亡情况。A～D：各组TUNEL（A1～D1）、DAPI（A2～D2）和Merge（A3～D3）荧光染色图片，标尺=10 μm。A：正常对照组；B：NaAsO2 组；C：低剂量DMF 组；D：高剂量DMF 组；E：各组MIN6 细胞凋亡率分析。*P＜0.05 vs 正常对照组；#P＜0.05 vs NaAsO2 组；△P＜0.05 vs 低剂量DMF 组.

2.3 MIN6 细胞ROS 水平比较

NaAsO2组中代表ROS的DCF绿色荧光强度明显高于正常对照组；与NaAsO2组比较，DMF预处理组DCF绿色荧光强度显著降低，且存在明显的剂量-反应关系，差异有统计学意义（图3A、3B）。

图3 MIN6 细胞内ROS 含量情况。各组DCFH-DA 荧光探针染色图片。A：正常对照组；B：NaAsO2 组；C：低剂量DMF 组；D：高剂量DMF 组。标尺=10 μm。E：各组MIN6 细胞内DCF 荧光强度比值分析。*P＜0.05 vs 正常对照组；#P＜0.05 vs NaAsO2 组；△P＜0.05 vs 低剂量DMF 组.

2.4 MIN6 细胞Nrf2 mRNA 和蛋白表达水平比较

与正常对照组比较，MIN6 细胞经4 μmol/L NaAsO2染毒6 h 后，细胞内Nrf2 mRNA 和蛋白表达明显增多。经25、50 μmol/L DMF 预处理6 h 后，再经4 μmol/L NaAsO2作用6 h 后，细胞内mRNA和Nrf2 蛋白表达显著高于NaAsO2组，且存在明显的剂量-反应关系，差异有统计学意义（图4A、4B、4C）。

图4 MIN6 细胞内Nrf2 mRNA 和蛋白表达情况

2.5 MIN6 细胞Nrf2 蛋白定位表达情况比较

正常对照组细胞内的红色荧光弱，主要定位于细胞质中。经NaAsO2处理后，细胞内的Nrf2 红色荧光增强，并出现核转位，主要定位于细胞核中。DMF 的预先干预后，再经NaAsO2处理，可见细胞核内的Nrf2 红色荧光进一步增强（图5）。

图5 MIN6 细胞内Nrf2 蛋白定位表达情况。标尺=10 μm。A1～D1：Nrf2 表达；A2～D2：DAPI 染色；A3～D3：合并。A：正常对照组；B：NaAsO2 组；C：低剂量DMF 组；D：高剂量DMF 组.

2.6 MIN6 细胞Ho-1、Trx1、Gclc、Gclm mRNA 表达水平比较

与正常对照组比较，NaAsO2组MIN6细胞内Ho-1、Trx1、Gclc 、Gclm mRNA表达显著提升；25、50 μmol/L DMF预处理组MIN6细胞Ho-1、Trx1、Gclc、Gclm mRNA表达水平明显高于NaAsO2组，且存在明显的剂量-反应关系，差异有统计学意义（图6）。

图6 各组Ho-1、Trx1、Gclc 、Gclm mRNA 表达水平

3 讨论

砷是一种类金属元素，位于化学元素周期表第四周期第VA 族，广泛分布在大气、水和陆地等自然环境中，以无机砷和有机砷2 种形式存在，其中无机砷为剧毒。人类可以通过饮用受污染的水、食用受污染的食品、吸烟、工业加工等多种途径接触到无机砷。砷是世界卫生组织列出的引起重大公共卫生关注的10 种化学品之一，目前全球约有3 亿人处于高砷暴露的威胁中[1-2]。长期接触无机砷，可导致慢性砷中毒。流行病学研究显示，无机砷在饮用水中的浓度＞50 μg/L 时，无机砷暴露与2 型糖尿病[3]、高血压[4]、心血管疾病[5]，甚至癌症[6]等多种疾病的发生密切相关。

胰腺内分泌部又称胰岛，是由十多个到数百个细胞组成的内分泌细胞团，分布于胰腺外分泌部的小叶内。胰岛中含有A、B、D、PP、D1 等细胞，其中B 细胞又称β 细胞，约占胰岛细胞总数的70%，主要功能为合成和分泌胰岛素。胰岛素是体内唯一的一种降血糖的激素，因此胰岛β 细胞损伤引发胰岛素合成或分泌障碍就会导致糖尿病的发生。氧化应激是砷中毒最重要的发病机制之一[7-8]。Nrf2 是细胞内抗氧化反应的核心调控者，在机体各种组织、器官几乎均有表达。生理状态下，Nrf2 与抑制蛋白Keap1 偶连锚定在胞浆，当受到亲电子化合物或氧化物攻击时，Nrf2 与Keap1 解偶连，并转位到细胞核内，与目的基因5’端抗氧化反应元件（antioxidant response elements，AREs）结合，增加其调控的抗氧化基因的表达，提高细胞抗氧化的能力[9-10]。Pi 等[11]在永生化人角质形成细胞HaCaT中首次发现砷暴露能够在转录和蛋白水平上增加Nrf2 的表达，提高Nrf2 相关基因的表达。本课题组前期的研究结果也已证实，亚砷酸钠暴露能够诱导小鼠胰岛MIN6 细胞内Nrf2/ARE 通路的活化，并利用Nrf2 基因沉默的MIN6 细胞证实Nrf2/ARE通路的激活在亚砷酸钠诱发的氧化应激损伤中发挥保护作用[12-14]。

DMF 商品名为Tecfidera，2013 年被美食品药品监督管理局批准，列入临床用药，用于治疗复发型多发性硬化[15]。2021 年正式获得中国国家药品监督管理局批准上市[16]。近来，随着药物研究的深入，发现DMF 除多发性硬化症以外，还对多种疾病具有治疗潜力，例如DMF 可以通过GSH-Gpx4通路诱发铁死亡和有效抑制STAT3 磷酸化，对弥漫性大B 细胞淋巴瘤不同亚型发挥抗肿瘤作用[17]。DMF 亦是Nrf2 激动剂，以往研究已显示DMF 能够以Nrf2 依赖的方式减少心肌缺血/再灌注损伤[18]；DMF 可以通过激活Nrf2 信号通路抑制糖尿病引起的心肌组织损伤等[19，20]。本研究以小鼠胰岛β 细胞株MIN6 为研究对象，探讨DMF 在亚砷酸钠诱发的氧化应激损伤中的作用及相关机制，为砷致2型糖尿病的预防与治疗提供实验依据。实验结果显示，与NaAsO2组比较，DMF 预处理可以显著提高MIN6 细胞活性，减少细胞凋亡数量，降低细胞内ROS 的水平，提示DMF 预处理后显著降低亚砷酸钠对MIN6 细胞氧化应激损伤，发挥保护作用。为了进一步探究DMF 对亚砷酸钠诱发的氧化应激损伤的保护作用机制，本课题组检测了各实验组细胞内Nrf2/ARE 信号通路表达情况，结果显示，与NaAsO2组比较，DMF 预处理能够明显增加细胞内的Nrf2 mRNA 和蛋白表达水平，免疫细胞荧光染色可见Nrf2 蛋白在细胞核内聚集增强，并与DMF浓度存在显著的剂量-效应关系。另外，DMF 预处理显著上调Nrf2 下游调控的Ho-1、Trx1、Gclc 、Gclm 等ARE 目的基因的mRNA 表达水平。这些结果说明DMF 可能是通过上调Nrf2/ARE 信号通路，拮抗亚砷酸钠对胰岛MIN6 细胞氧化应激损伤，发挥保护作用。