香料作物油樟叶内米曲霉菌的分离鉴定及抗菌活性研究※

●邓梦玲 任 静

（1.宜宾学院农林与食品工程学部 四川 宜宾 644000；2.四川省油樟工程技术研究中心 四川 宜宾 644000）

油樟（Cinnamomum longepaniculatum（Gamble））是我国特有的樟科樟属常绿乔木，由于其具有生长迅速、木制优良、含丰富芳香油类物质及抗逆性强等优点，在四川宜宾地区广泛种植，是当地主要的经济树种之一，因此又称“宜宾油樟”[1]。油樟的根、茎、叶及果实含有多种芳香油，是香料、日化等产品的重要原料。此外，油樟具有阻断肝癌细胞的分裂增殖[2]、抗氧化[3]、抗炎和镇痛抑菌[4]等药用价值，其在医药和食品工业等方面的研究和应用也取得到较大进展。

植物内生真菌是指其某一段或整个生活周期定殖于健康植物根、茎、叶、花、果实等组织中的一类微生物共生体，不对植物造成明显损伤[5]。内生真菌与植物间形成了互利互惠的共生关系，内生真菌可产生具有生物活性的次级代谢产物，促进植物生长和增强宿主抗逆性[6]，植物则为内生真菌的生长发育提供了生态位[7]。油樟作为重要的香料作物，其内生真菌的多样性和功能研究也越来越受到关注，目前主要集中在内生真菌的分离鉴定、多样性、分布差异、对植物病原的抑制作用等方面，未见其对常见细菌性病原抑制作用的研究。由于人类及动物的细菌性疾病频发及抗生素的滥用，细菌对抗生素的耐药性越来越严重，甚至出现了超级耐药菌，给人类公共卫生安全带来巨大威胁，而药物残留造成的食品安全问题也不可回避，寻求生态、健康、有效的抗菌新策略迫在眉睫。

在前期的研究中，油樟内生真菌对植物性病原显示出较好的抑制作用[8]，受此启发，本试验采用组织块分离法分离培养油樟叶内生真菌，对其进行分类鉴定，并探究其发酵产物对常见几种细菌性病原菌的抗菌作用，旨在挖掘和评价其在细菌性疾病防治中的应用潜力，为将来油樟内生真菌的资源的开发和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 油樟叶采集于四川省宜宾市高县月江森林经营所，供试菌种金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌均由四川省油樟工程技术研究中心提供。

1.1.2 试剂 PDA培养基、PDB培养基、LB培养基、MH培养基；真菌DNA提取试剂盒、Master Mix、DNA Marker均购自天根生化科技（北京）有限公司；PCR引物由北京擎科生物科技有限公司（成都分公司）合成。

1.2 试验方法

1.2.1 内生真菌的分离纯化 将油樟叶经流水冲洗后，无菌条件下用无菌水冲洗2～3次，75%酒精浸泡30 s，再用无菌水冲洗2～3次，2%次氯酸钠溶液浸泡消毒5 min，最后用无菌水清洗5次。吸取200 μL最后一次洗脱水均匀涂布于PDA和LB培养基上。无菌条件下，用剪刀将灭菌后的组织周围剪去，将叶剪成0.5 cm×0.5 cm大小的组织块接种于PDA培养基，每个平板接种4个，每组3个重复，置于生化培养箱22℃培养7 d。以洗脱水涂布的平皿未长出菌落有效，将分离得到的内生真菌进行纯化，纯化完成后接种于PDA斜面培养基，4℃保存备用。

1.2.2 分离菌的鉴定

1.2.2.1 形态学鉴定 观察记录菌落生长速度、菌落形态特征、产孢情况等，用显微镜观察菌丝形态及其孢子结构，结合真菌鉴定手册进行初步鉴定。

1.2.2.2 分子生物学鉴定 使用真菌DNA提取试剂盒提取分离菌的总DNA，选择通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行PCR扩增[9]。PCR反应体系：ddH2O 8.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，引物各1 μL，模板DNA 2 μL；PCR扩增程序：94℃预变性5 min，94℃预变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸5 min。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳后送北京擎科生物科技有限公司（成都分公司）测序。测序结果登录到NCBI GenBank 数据库中运用 BLAST比对鉴定，并在NCBI中下载相似序列进行菌种的系统发育分析。

1.2.3 抗菌特性的测定 将纯化的菌株接种于PDB液体培养基，在恒温摇床150 r/min培养7 d，将发酵液4℃离心2 min，吸取上清液，并用0.22 μm过滤器过滤，得到菌株发酵液。将5 mm空白滤纸片放入制备好的发酵液中浸泡24 h作为试验样片，备用。将供试菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌分别接种于LB肉汤培养基，37℃培养24 h，用无菌生理盐水调整至1×106mL-1，分别吸取供试菌200 μL均匀涂布于MH琼脂培养基制成菌平板，每种菌3个重复。使用无菌镊子将试验样片等距贴于菌平板，37℃培养24 h，游标卡尺测量抑菌圈直径并记录。

2 结果与分析

2.1 内生真菌的分离和鉴定

通过组织块分离法从油樟叶分离纯化得到一株内生真菌，暂命名为YZ-1。菌株菌落形成较快，质地疏松，嫩黄色（图1-A）。在显微镜下，菌株分生孢子头呈放射状，顶囊近球形或烧瓶形，表面较粗糙，子囊分生孢子卵圆形，近柠檬形（图1-B）。对照真菌鉴定手册，YZ-1形态与霉菌属真菌较为相似，初步鉴定其为霉菌属真菌。

图1 菌株YZ-1形态

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在500～750bp左右出现目的条带（图2），将PCR产物送检北京擎科生物公司，获得序列登录到GenBank 利用BLAST进行同源序列比对，结果显示其与曲霉属真菌同源性较高。下载与菌株YZ-1序列同源性较高的核酸序列，通过MEGA 7.0软件采用Neighbo r-joinng（NJ）构建发育树，如图3所示，菌株YZ-1与曲霉属米曲霉菌（Aspergillus oryzae）聚在同一分支，遗传距离较近，结合形态学鉴定结果，确定本次分离的油樟源内生真菌为米曲霉菌。

图2 菌株YZ-1 rDNA-ITS PCR扩增电泳图

图3 菌株YZ-1的rDNA-ITS序列的N-J系统发育树

2.2 抗菌特性的研究

由图4可知，YZ-1菌株发酵液对蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌活性，对大肠杆菌无抑菌活性，对金黄色葡萄球菌抗菌效果最好，经测抑菌圈直径达（12.1±0.3 mm）。

3 讨论

目前，真菌的鉴定主要采用传统形态学分类法和分子生物学方法。由于培养条件的差异，真菌产生的形态差异较大，如在人工培养条件不产生孢子，且形态学鉴定要求具备丰富的经验，故宏观的形态学鉴定缺乏准确性[10]。本研究分离得到的菌株YZ-1结合形态学和ITS序列鉴定确定其为米曲霉菌，先前王涛等[8]研究证实油樟内生真菌中确有曲霉属真菌，与本研究结果一致。米曲霉是曲霉属真菌的一个常见种，有学者从云南滇重楼、黑果枸杞中也曾分离得到。目前，已证实米曲霉菌含有多种药理活性物质，具有抗肿瘤、抗菌、免疫抑制、抗高血压、神经麻痹、酶抑制等作用[11]，尽管对其代谢产物认知仍十分有限，但其发展潜力已经凸显，未来在食品、医药和饲料工业中将有更好的应用前景。

自1993年国外学者Stierle等[12]首次从红豆杉内生真菌分离得到一种萜类化合物具有抗肿瘤的活性后，越来越多的内生真菌生物活性物质不断被发现。大量研究证实，植物内生真菌能够产生丰富的次级代谢产物，且多种有活性的成分已被纯化鉴定，显示了植物内生真菌的潜在应用价值。聂丽娟[13]证实米曲霉菌对金黄色葡萄球菌有明显抑制作用。沈业寿等[14]也证实米曲霉的发酵产物中A3042对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有抑菌活性。杨秀芬等[15]检测到黑果枸杞源米曲霉RER4的发酵产物中含有对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等具有抑制作用的物质。本研究中，油樟源内生真菌YZ-1的发酵液对蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑制作用，而对大肠杆菌无明显抑制作用。与聂丽娟、沈业寿、杨秀芬米曲霉菌中对金黄色葡萄球菌具抑制作用的研究结果一致，但菌株YZ-1对大肠杆菌无作用，究其原因是否与不同植物源内生真菌的种间差异有关，还需进一步研究。

本试验仅对米曲霉菌YZ-1发酵液对几种常见细菌性病原抗菌特性进行了初步探究，而该菌的发酵液是否具有广谱抗菌活性，后期还需增加拮抗菌株的种类进行进一步研究。金黄色葡萄球菌是环境及临床常见的细菌之一，其对抗生素的耐药现象十分严重。本研究使用的是YZ-1菌株的发酵液，尚未进行萃取和浓缩，其含有的抗菌成分浓度较低，后期将对YZ-1的培养条件进行探索，筛选出抗菌效果最好的培养条件，进行大规模发酵，并分离提纯其中的抗菌化合物。