半滑舌鳎源溶藻弧菌的分离鉴定※

●李 彬 彭树德 白和平 高桂生 史秋梅

（1.秦皇岛抚宁区农业农村局 河北 秦皇岛 066004；2.唐山市食品药品综合检验检测中心 河北 唐山 063000；3.唐河县和杰农业专业合作社 河南 南阳 473000；4.河北科技师范学院 河北 秦皇岛 066004）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）属于弧菌科（Vibrionaseae）、弧菌属（Vibrio），是一种嗜盐性、兼性厌氧、革兰氏阴性短杆菌，是常见的海洋条件致病菌。近年来，水生生物感染溶藻弧菌后主要症状为皮肤溃疡、烂尾、腹水、烂眼等，该病给水产养殖业造成了巨大的损失；人体受伤时容易引起创伤部位感染，误食容易引起腹泻，免疫力降低时可引起结膜炎、耳炎、呼吸道感染、血液感染和颅内感染等[1]，因此造成的食源性污染严重威胁着人类的生命安全。随着半滑舌鳎养殖规模的扩大，在养殖过程中各种疾病频发，溶藻弧菌为重要的病原之一，给半滑舌鳎养殖造成了巨大的危害。

本试验室于2021年8月对河北省秦皇岛市抚宁区某水产养殖场送检的5条濒死半滑舌鳎进行了临床诊断和细菌分离鉴定，以及药物敏感性敏试验，以期为溶藻弧菌病的临床诊断和防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

河北省秦皇岛市抚宁区某水产养殖场送检的患皮肤溃疡病且濒死的半滑舌鳎5条，体长10～15 cm。

1.2 试剂及仪器

8%绵羊血琼脂培养基、TCBS琼脂培养基，购自青岛海博生物技术有限公司；DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；抗生素药敏纸片，购自广州市益满生物科技有限公司；ID32E生化鉴定试纸条、ATB全自动生化鉴定仪，购自法国生物梅里埃股份有限公司；革兰氏染色试剂盒，购自北京博奥阔达生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 细菌的分离纯化及形态学观察 在超净台中无菌取溃疡病灶深部病变组织于1.5 mL EP离心管中，加5倍体积灭菌PBS充分匀浆，离心后用接种环蘸取上清液在血琼脂平板上均匀涂布，30℃培养24 h后挑取优势菌纯化至菌落形态单一，挑取分离菌划线于TCBS培养基观察菌落形态与生长特性；另挑取分离菌进行革兰氏染色，观察分离菌染色特性及菌体形态。

1.3.2 分离菌的生化鉴定 用比浊仪调整菌液浓度为0.5麦氏比浊度，使用ID32E生化鉴定试纸卡结合ABI自动生化鉴定仪进行分离菌的生化鉴定试验，试验操作及结果判定严格按照说明书执行。

1.3.3 抗生素药敏试验 采用K-B试纸法进行抗生素药敏试验，取100 μL过夜培养的分离菌菌液均匀涂布于TCBS琼脂培养基，药敏纸片等间距贴在培养基上，30℃培养箱倒置培养24 h后测量抑菌圈直径，判断药物敏感性。

2 结果与分析

2.1 分离菌的生长特性与形态特征

分离菌在TCBS琼脂培养基上生长良好，光滑圆润，为凸起黄色菌落（图1-A）；在血平板培养基上为大小中等、光滑乳白色的菌落（图1-B）；经革兰氏染色，为阴性短杆菌、两端顿圆，呈散在或成对存在（图1-C）。

图1 分离菌的培养及形态特征

2.2 分离菌的生化鉴定结果

经24 h培养的生化鉴定试纸条，用ATB自动生化鉴定仪读取生化鉴定结果，如表1所示，分离菌生化特性与溶藻弧菌生化特性相似率达96%，符合率较高。

表1 生化鉴定结果

2.3 抗生素药敏试验

取培养24 h后的药敏琼脂平板测量各种药物抑菌直径，结果见表2。分离菌对头孢曲松、环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考高度敏感，对阿米卡星、新霉素、卡那霉素、替米考星中度敏感，对氨苄西林、阿莫西林、多西环素、土霉素、磺胺间甲氧、磺胺邻二甲氧、复方新诺明耐药。

表2 抗生素药敏试验结果

3 讨论与结论

本研究通过对分离菌的生长特性、革兰氏染色、生化鉴定结果分析，初步鉴定分离菌为溶藻弧菌。在本研究中分离菌生化特性赖氨酸脱羧酶为阳性，与徐晓丽等[2]分离的半滑舌鳎源溶藻弧菌为赖氨酸脱羧酶阴性的结果不同，但与李卓昱等[3]等分离的溶藻弧菌H1B6赖氨酸脱羧酶阳性的结果相同，造成生化特性的差异可能与菌株、仪器、生化鉴定试纸条等因素有关。后续可使用弧菌科专用鉴定试纸条等进一步验证分离菌的生化特性。通过对分离菌进行抗生素药敏试验结果分析，发现分离菌对头孢曲松、环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考高度敏感。临床生产过程中建议选择敏感药物对该病进行预防与治疗，但要遵守水产用药相关法规。