宜宾油樟皂制备及其抑菌能力的研究*

李秀萍，陆 兵，郭云霞，张敬慧，程 偲，李小燕

(宜宾职业技术学院，四川 宜宾 644003)

油樟(Cinnamomum longepaniculatum(Gamble)N.Chao)是属于樟科樟属的常绿乔木[1]。四川宜宾为我国的油樟主产地，素有“油樟王国”之称，宜宾现有油樟约3.3万公顷，占我国和全球油樟资源比例分别为85%和65%[2],所以生长于该地的油樟也被称为“宜宾油樟”。宜宾油樟的营养器官——根、茎、叶均可用于提取樟油[3]，但不同部位提取的樟油成分含量有较大差异。2020年宜宾油樟油的产量约为1.2万吨，分别占四川省、全国和全球的90%以上、70%以上和50%左右，可见宜宾油樟油产量极其丰富。油樟精油包含桉叶素、萜品醇、水芹烯、芳樟醇、松油醇等活性成分[4]，具有抗炎、抗氧化[5-7]、抗自由基[8]、抗菌和抗癌[9]的作用，同时镇痛[10]、治疗皮肤真菌病[11]、驱蚊、止痒、提神的功效。此外，樟油还被报道具有抗细菌、真菌和病毒的广谱抑菌活性[12-14]。陶翠等[15]对油樟叶挥发油抗须毛癣菌,犬小孢子菌和石膏小孢子菌的效果进行研究，发现其对这三种真菌有较强的的杀菌作用。张超等[16]以油樟叶为原料，用有机溶剂提取得到油樟挥发油，用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌三种常见致病菌的抑制活性研究，发现其对这三种细菌有不同程度的抑制作用。随着人们健康意识的提高，特别是此次新型冠状病毒的爆发与持续，使人们越来越认识到日常生活中消毒杀菌对预防各种病原菌的重要作用。但是人们平时日常消毒杀菌主要依靠消毒液、酒精等产品，这些产品虽然能消毒杀菌，但却也带来了令人不适的气味，且对人体直接使用，会对人体皮肤造成损害。而油樟精油具有上述优点，因此可以油樟精油与肥皂结合，制成油樟精油皂，用于人们日常洗手、洗澡和洗衣等消毒杀菌。鉴于还没有文献对樟油皂进行报道，本文以通过优化以椰子油、橄榄油和棕榈油为皂基配方，以及油樟精油添加量，制得宜宾油樟皂，并对宜宾油樟皂进行理化检测、感官评价与抑菌能力的探究，为将资源丰富的宜宾樟油用于开发宜宾油樟皂提供科学依据。

1 实 验

1.1 材料与试剂

油樟精油，购于宜宾县泥溪镇；椰子油、橄榄油、棕榈油，规格均为1000 mL，均购于宜宾绿源超市。氢氧化钠、琼脂等试剂均为市售分析纯，大肠杆菌为实验室保藏菌株。

1.2 仪器与设备

BSC-1304IIA2超净工作台，苏州安泰空气技术公司；BJPX-400恒温培养箱，卓绝医疗器械有限公司；CJ-881磁力搅拌器，金坛市医疗器厂；YXQ-LS-75SII立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅医疗生物公司；PHS-2FpH计，上海仪电科学仪器公司；JD400-3电子分析天平，沈阳龙腾电子有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 宜宾油樟皂制备工艺流程

椰子油、橄榄油、棕榈油 → 于烧杯中水浴加热(50～60 ℃) → 分次加入NaOH溶液(50 ℃) → 加入蒸馏水 → 搅拌皂化(500 r/min) → 出现结膏点 → 加入油樟精油 → 搅拌3 min → 入模 → 冷却 → 风干 → 脱模 → 宜宾油樟皂

1.3.2 皂基配比的优化

宜宾油樟皂以椰子油、橄榄油和棕榈油作为基础油脂，根据不同的油脂性状特点，以此来确定基础油脂的比例。皂基油脂配比，需要参考硬度值，即为为INS。INS硬度值，是在扣除水分及其他添加物以外，不同的油脂配方的皂，皂在相同湿度环境、相同的时间，皂体呼吸空气中的水分之后易于熔化后变软的程度。油脂配方的INS值在160～180最佳，以此为基础优化宜宾油樟皂皂基的配比。

表1 皂基配比的优化Table 1 Optimization of soap base ratio

1.3.3 不同浓度宜宾油樟皂的制备

按1.3.1的制备步骤，在最佳皂基中分别加入0%、0.5%、1%、1.5%和2%的油樟精油，制备一系列浓度的宜宾油樟皂，依次标记为A～E组,进行理化性质检测，并用于后续实验。

1.3.4 宜宾油樟皂理化指标检测和感官评价

1.3.4.1 水分和挥发物含量测定

称取一定量的宜宾油樟皂，放置于干燥的蒸发皿中，将它们一起称重后，放到烘箱内105 ℃干燥1 h。将其取出，用搅拌棒将宜宾油樟皂压碎至细粉状。再将其放回烘箱中，105 ℃干燥3 h后，取出，置于干燥器内，冷却至室温称量。重复操作，每次置于烘箱内1 h，直至恒重，并记录最后称量结果。按下式对水分和挥发物含量进行计算，以三次平行测定结果的算术平均值表示至整数个位作为测定结果。

式中：W为水分和挥发物含量，%；m0为宜宾油樟皂质量，g；m1为烘干前蒸发皿与宜宾油樟皂的总质量，g；m2为烘干后蒸发皿与宜宾油樟皂的总质量，g。

1.3.4.2 宜宾油樟皂pH值测定

精确称取1.3.3中的A～E组宜宾油樟皂1.000 g于烧杯中,用蒸馏水溶解，倒至100 mL容量瓶，用蒸馏水定容至刻度线。取适量的宜宾油樟皂溶液，用pH计进行pH测定。

1.3.4.3 宜宾油樟皂感官评价

随机选取20人对油樟手工皂的皂型效果和气味进行感官评价。皂型效果主要评价：表面有无开裂，质感硬、适中、软。气味主要评价：有无酸败气味。20人评价结束后，对评价结果进行统计，将占比最高的感官评价作为最终结果。

1.3.5 宜宾油樟皂抑菌能力探究

1.3.5.1 宜宾油樟皂的稀释液制备

分别称取1.3.3中的A～E组宜宾油樟皂各5.000 g，加入无菌水，充分震荡摇匀，配置成50%的不同油樟精油浓度的宜宾油樟皂溶液。

1.3.5.2 大肠杆菌菌悬液的制备

在无菌操作台中，用接种环从大肠杆菌培养皿上轻刮菌苔1环，收集到内盛25 mL无菌生理盐水的三角瓶中，配制成大肠杆菌浓度为105 cfu/mL的菌悬液。

1.3.5.3 大肠杆菌染菌平板的制作

在无菌操作台中，将已灭菌且冷却至50 ℃的大肠杆菌培养基倒入无菌的培养皿中，每个皿的培养基为15～20 mL。在大肠杆菌培养基凝固后，每皿中加入1.3.5.2中的大肠杆菌菌悬液0.1 mL，用无菌涂布棒将菌悬液涂布均匀，静置30 min。

1.3.5.4 宜宾油樟皂抑菌活性测定[17]

将直径为10 mm的灭菌圆形滤纸，分别放入1.3.5.1不同油樟精油浓度的宜宾油樟皂溶液和无菌水中浸泡2 h，然后沥干至不滴水的湿润状态。将浸有不同油樟精油浓度的宜宾油樟皂溶液的滤纸片分别贴在1.3.5.3中涂布有大肠杆菌的培养基上。另每培养皿贴2片以无菌水浸泡的滤纸作为空白对照。将大肠杆菌培养皿置于37 ℃恒温培养箱中，倒置培养，24 h后观察。通过滤纸周围是否有明显的抑菌圈，确定抑菌效果。每个实验进行3次平行。

1.3.5.5 宜宾油樟皂最小抑菌浓度的测定

取1.3.5.1中E组的宜宾油樟皂溶液，加无菌水进行二倍梯度稀释，分别稀释成原溶液浓度的100%、50%、25%、12.5%和6.25%的宜宾油樟皂稀释溶液。分别取不同稀释度的宜宾油樟皂稀释溶液1 mL与已灭菌且冷却至50 ℃的大肠杆菌培养基混合均匀后，倒入到培养皿中，待培养基凝固后，即可得到含不同宜宾油樟皂稀释度的平板。在平板上，加入大肠杆菌菌悬液0.1 mL，涂布均匀，置于37 ℃恒温培养箱中，倒置培养24 h后，观察菌体生长情况。有大肠杆菌生长标记为(+)，无大肠杆菌生长标记为(-)，以不生长大肠杆菌的最低浓度为宜宾油樟皂的最低抑菌浓度(MIC)。每个实验进行3次平行。

2 结果与讨论

2.1 皂基的配比优化实验结果

在椰子油:橄榄油:棕榈油配比分别为30%:40%:30%、30%:30%:40%、40%:30%:30%下，对不同皂基的配比进行比较，确定宜宾油樟皂的最优皂基配比。皂基的配比优化实验结果见表2。

表2 皂基的配比优化实验结果Table 2 Experimental results of soap base ratio optimization

由表2可知，三种不同宜宾油樟皂皂基配比的水分和挥发物含量均为13%，均符合中国轻工行业标准QB/T 2485-2008《香皂》(水分和挥发物含量 ≤ 30%)。三种不同皂基的pH值均在8左右，说明用于皂化的氢氧化钠均已消耗完全，与不同皂基配比无关，此时显示出的弱碱性是由氢氧化钠与油脂发生皂化反应后生成的钠盐造成的。从皂型效果来看，皂基配比①最好，而皂基配比②太过干燥而开裂，皂基配比③太过湿润而具有粘感。因此，选取皂基配比①，即椰子油:橄榄油:棕榈油配比为30%:40%:30%作为宜宾油樟皂的最优皂基配比。

2.2 不同浓度的宜宾油樟皂理化指标和感官评价实验结果

在椰子油：橄榄油：棕榈油配比为30%:40%:30%时，添加0%、0.5%、1%、1.5%和2%的油樟精油，制得不同油樟精油浓度的宜宾油樟皂，并对其进行理化指标测定和感官评价，其结果见表3。

表3 不同浓度的宜宾油樟皂理化指标和感官评价实验结果Table 3 Physical and chemical indexes and sensory evaluation results of different concentrations of Yibin camphor soap

由表3可知，添加不同浓度的油樟精油后，宜宾油樟皂的水分和挥发物含量在12%～18%之间，仍符合中国轻工行业标准QB/T 2485-2008《香皂》(水分和挥发物含量≤30%)，pH值在7.92～8.26之间，说明油樟精油添加对pH无影响。同时A～E组宜宾油樟皂的皂型均无开裂，质感良好，无酸败气味。由此可以看出宜宾油樟皂对油樟精油的可溶性较大，适合制作不同浓度的宜宾油樟皂。

2.3 宜宾油樟皂抑菌活性实验结果

取油樟精油浓度分别为0%、0.5%、1%、1.5%、2%的宜宾油樟皂，加无菌水，分别配制成50%的宜宾油樟皂溶液，以无菌水作为空白对照，考察其对大肠杆菌的抑菌活性，宜宾油樟皂抑菌活性结果见表4。

表4 宜宾油樟皂抑菌活性实验结果Table 4 Experimental results of antimicrobial activity of Yibin camphor soap

由表4可知，当宜宾油樟皂中油樟精油添加量为0%和0.5%时，与无菌水空白对照一样，在大肠杆菌平板上的滤纸片周围均无明显抑菌圈出现，说明对大肠杆菌无抑菌活性。油樟精油含量大于等于1%时，随着油樟精油浓度的升高，有明显的抑菌圈，说明对大肠杆菌的抑制效果越来越明显。其中油樟精油添加量为1.5%、2%时，对大肠杆菌的抑制作用最为明显。

2.4 宜宾油樟皂最小抑制浓度的测定实验结果

将油樟精油浓度为2%的宜宾油樟皂，加适量无菌水配制成50%的溶液，再加无菌水进行二倍梯度稀释，分别稀释成原溶液浓度的100%、50%、25%、12.5%和6.25%的宜宾油樟皂稀释溶液，考察宜宾油樟皂的最小抑制浓度，其结果见表5。

表5 宜宾油樟皂最小抑制浓度的测定实验结果Table 5 Experimental results of the determination of the minimum inhibitory concentration of Yibin camphor soap

由表5可知，油樟精油添加量为2%的宜宾油樟皂，当其稀释度为6.25%、12.5%和25%时，大肠杆菌生长，此时无抑菌作用；当其稀释度为100%和50%时，大肠杆菌不生长，此时有抑菌作用。因此油樟精油添加量为2%的宜宾油樟皂最小抑制浓度为50%。

3 结 论

在皂基优化实验，通过比较不同配比皂基含水和挥发物含量、pH和皂型效果，确定了皂基最优配比为椰子油:橄榄油:棕榈油为30%:40%:30%。不同油樟精油添加量制成的宜宾油樟皂的含水和挥发物含量在12%～18%，符合中国轻工行业标准QB/T 2485-2008《香皂》(水分和挥发物含量≤30%)，pH在8.0左右，属于弱碱性，皂型效果良好，无酸败气味。将宜宾油樟皂配成50%浓度的溶液，加滤纸浸泡，发现当油樟精油添加量为0%和0.5%时，滤纸周围为抑菌圈，对大肠杆菌无抑菌活性；当油樟精油添加量在1%～2%时，有明显抑菌圈，对大肠杆菌有抑菌活性。2%油樟精油浓度的宜宾油樟皂进行二倍稀释，发现其最小抑制浓度为50%。通过以上实验，得到了制备宜宾油樟皂的工艺条件，验证了其抑菌活性，为宜宾油樟皂的生产提供了科学依据。