饲粮能氮比对简州大耳羊粪便排泄参数及微生物区系的影响

付敏，陈天宝，欧阳佚亭，赖靖雯，陈敏，曾洪良

（四川省畜牧科学研究院，动物遗传育种四川省重点实验室，成都 610000）

肉羊养殖是我国畜禽养殖的重要组成部分，与1961 年相比，2021 年肉羊出栏量增长了34.4 倍，羊肉产量增长了46.7 倍，肉羊产业稳步增长[1]。然而，我国肉羊养殖也面临着巨大的挑战：一方面肉羊营养需要量标准不完善，导致生产上饲粮配方差异大，能量蛋白质不平衡，既浪费饲料资源，又造成环境氮污染。肉羊对养分的消化主要通过瘤胃微生物发酵，只有饲粮提供的能量和氮含量达到微生物需求平衡时，微生物才能达到最佳生长状态，进而有利于养分的消化吸收，因此，饲粮适宜的能氮比是合理配制反刍动物饲粮的基础[2]。研究表明，饲粮适宜的能氮比可以提高肉羊生产性能和养分消化率[3-5]；蛋白质水平过高导致的能氮不平衡问题，不仅会降低肉羊生产性能，还会增加氮的排泄[5-6]，粪便中氮含量与饲料蛋白质摄入量有很强的正相关关系[6-7]。李闯[2]、张继伟等[4]、柴贵宾等[5]分别提出了不同饲养方式下本地羊适宜的饲粮能氮比，但由于肉羊的窄生态适应性，不同品种肉羊饲粮能氮比适宜值仍然需要根据品种特性和饲养方式进一步探索和研究。另一方面，随着我国肉羊养殖数量增加和规模化程度提高，养殖污染问题日益突出，威胁到生态环境和人居安全，而且反刍动物对环境的影响是其他牲畜的3~10 倍[8]。畜禽粪便排泄参数不仅能反映畜禽营养健康状况，更是开展畜禽粪污治理和资源化利用的基础数据。国外对羊粪产排特性研究较早，美国农业工程师协会发布了羊的粪尿产生量及粪尿中污染物的含量[9]，而国内对肉羊粪便产排系数监测的重视度不高，研究较晚，杨硕等[10]研究了规模化羊场杜泊羊和小尾寒羊不同季节粪便主要成分含量差异，粪便产生量研究未见详细报道。我国每10 年开展一次的污染普查，只针对生猪、牛、肉鸡和蛋鸡进行产排污系数原位监测，而缺少对羊的产排污监测，这给肉羊粪污治理及资源化利用带来了盲目性。

简州大耳羊是我国人工培育的肉用山羊新品种，生长快、肉质好，在南方地区广泛饲养[11]。由于缺少针对性的饲养标准，生产上饲粮能氮比差异较大，这可能导致粪尿特性参数变化，不利于粪污减排和高效利用。因此，本试验旨在探索全价颗粒饲粮不同能氮比（代谢能/总氮）对生长育肥期简州大耳羊粪便排泄参数、氮排泄参数以及粪便微生物区系的影响，为简州大耳羊的低碳高效养殖和粪便资源化利用提供科技支撑。

1 材料与方法

1.1 试验设计

本研究采用单因子试验设计，选择32 只体质量为（26.16±2.39）kg 的健康简州大耳羊，随机分配到编号为a、b、c、d 的4 个试验组，每组8 只羊（公母各4只），分别饲喂能氮比（ME/N）为0.59、0.51、0.43、0.35的全价颗粒饲粮，适应30 d后移入羊代谢笼开展12 d全收粪尿试验（预饲7 d，正式5 d），测定试验羊粪尿和氮排泄参数，然后在正式试验第5 天收集试验羊新鲜直肠粪便测定粪便微生物区系。试验饲粮配方和能氮比设计参照课题组前期研究[3]，能氮比为饲粮代谢能浓度与总氮浓度比值，试验饲粮组成及养分含量见表1。

表1 饲粮组成及养分含量（干物质基础，%）Table 1 Composition and nutrient content of experimental diets（DM basis，%）

1.2 饲养管理

饲养试验前对羊舍和用具全面清洗、晾干、消毒。饲养期间按照羊场管理规范进行疫病防控和饲养管理，自由饮水，自由采食。正式试验期，对试验羊空腹称质量后移入羊代谢笼，单只单笼饲养，先预饲7 d以确保肉羊体况正常稳定，然后连续开展5 d 的全收粪尿试验，准确称量每只羊每日的采食量、粪便量和尿液量，记录圈舍环境温度、湿度和试验羊健康状况等。

1.3 样品采集与处理

饲粮样品：分别在饲粮加工完成的第1 天、适应期第15 天和正式试验期每日采集每组饲料样品200 g，测定干物质含量和总氮含量。

粪便样品：正式期每日8：00在每只羊的代谢笼特定位置放置干净带盖塑料桶，用于收集试验羊每次全部粪便，于次日8：00称取前1天粪便总量。粪便混匀后，采用四分法按照粪便总质量的20%采集粪便样品2份测定干物质含量、pH和总氮含量，粪便样品采集方法参照《畜禽粪便监测技术》（GB/T 25169—2022）。

尿液样品：正式期每日8：00 将干净的装有15 mL 4.5 mol·L-1H2SO4的接尿桶（容量5 000 mL）放置于羊代谢笼底部固定位置，收集每只羊全部尿液，于次日8：00 计量前1 天尿液总量，尿液混匀后，调整pH≤3（记录加酸量），并按照总质量的20%采集尿液样品用于测定总氮和氨氮。所有样品按照标准编号，4 ℃保存，送实验室检测。

粪便微生物样品：在正式期第5 天，用无菌镊子采集每头试验羊直肠末端新鲜无污染粪便，装入5 mL冻存管，并做好标记，-80 ℃冻存。

1.4 样品检测方法及指标计算

1.4.1 肉羊粪便及氮排泄参数检测与计算

饲料和粪便的干物质含量均参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[13]测定，粪便和尿液pH、总氮、氨氮参照NY/T 525—2021 测定。畜禽粪便的排泄量还与体质量呈显著正相关关系[14]，为了降低体质量变化带来的排泄量的差异，用单位代谢体质量粪便尿液（氮）排泄参数来衡量粪尿（氮）排泄量更具代表性。通过以下公式计算：

氮摄入量（g·d-1）=日采食干物质量（g·d-1）×饲粮氮含量（%）

日排粪氮（g·d-1）=日排粪便干物质量（g·d-1）×粪便总氮含量（%）

日排尿氮（g·d-1）=日排尿液质量（g·d-1）×尿液总氮含量（%）

日排总氮（g·d-1）=日排粪氮（g·d-1）+日排尿氮（g·d-1）

氮排泄率（%）=日排总氮（g·d-1）/日摄入氮量（g·d-1）×100%

单位代谢体质量粪便日排泄量（g·kg-0.75·d-1）=日排粪便干物质量（g·d-1）/羊活体质量0.75（kg0.75）

单位代谢体质量尿液日排泄量（g·kg-0.75·d-1）=日排尿液质量（g·d-1）/羊活体质量0.75（kg0.75）

单位代谢体质量粪氮日排泄量（g·kg-0.75·d-1）=日排粪氮（g·d-1）/羊活体质量0.75（kg0.75）

单位代谢体质量尿氮日排泄量（g·kg-0.75·d-1）=日排尿氮（g·d-1）/羊活体质量0.75（kg0.75）

1.4.2 肉羊粪便微生物菌群检测

粪便细菌多样性检测由天津诺禾致源生物信息科技有限公司完成，DNA提取和16S rRNA PCR扩增、测序及数据分析法参照Griffith等[15]的方法。每个试验组选择8只羊的粪便样品进行微生物菌群检测，分析粪便微生物菌群多样性，及在门和属水平上的组成和相对丰度。

1.5 统计分析

利用SPSS 20.0 软件One-way ANOVA 进行单因素方差分析，组间采用Duncan's 法进行多重比较，随后对饲粮能氮比进行线性（Linear）和二次曲线（Quadratic）回归分析。数据结果用平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 不同能氮比全价颗粒饲粮对简州大耳羊粪便排泄参数的影响

2.1.1 对粪便排泄参数的影响

如表2 所示，饲粮能氮比对试验羊干物质采食量、粪便排泄量、尿液排泄量及单位代谢体质量粪便日排泄参数均无显著影响（PA>0.05），4组试验羊干物质采食量平均为1.21 kg·d-1，粪便、尿液排泄量平均为1.25 kg·d-1和0.70 kg·d-1，粪便含水率平均为62.32%，单位代谢体质量粪便和尿液日排泄量平均为29.49 g∙kg-0.75·d-1和50.59 g∙kg-0.75·d-1。随着饲粮能氮比降低，粪便pH 呈线性增加（PL=0.004），且具有显著的组间差异（PA=0.029）；单位代谢体质量尿液排泄量呈线性增加（PL=0.046），从47.35 g∙kg-0.75·d-1增加到59.57 g∙kg-0.75·d-1，增加了25.81%。

表2 不同试验组简州大耳羊粪便排泄参数Table 2 The fecal excretion parameters of Jianzhou Da′er goats in different groups

2.1.2 对氮排泄参数的影响

如表3 所示，不同能氮比饲粮对试验羊粪氮、氮排泄率、单位代谢体质量粪氮日排泄参数无显著影响（PA>0.05），粪氮日排泄量为7.26~8.23 g·d-1，氮排泄率为63.60%~68.55%。但是，随着饲粮能氮比降低，氮的日摄入量、尿总氮排泄量、尿氨氮排泄量、日排总氮量、单位代谢体质量尿氮和单位代谢体质量总氮日排泄量均呈线性增加（PL<0.001），且具有显著的组间差异（PA<0.05），相对于a 组，d 组分别增加了54.90%、152.03 %、605.66%、63.82%、147.50%、60.82%。

表3 不同试验组简州大耳羊氮排泄参数Table 3 The nitrogen excretion parameters of Jianzhou Da′er goats in different groups

2.2 不同能氮比全价颗粒饲粮对简州大耳羊粪便微生物区系的影响

2.2.1 粪便样品16S rRNA 基因测序结果

4 组粪便32 个样本中共获得1 616 790 条优质细菌16S rRNA 基因序列，每个样本平均产生55 751.38条，序列平均长度为371.8 bp，有效标记（Effective Tags）中碱基质量值大于20（测序错误率小于1%）和30（测序错误率小于0.1%）的碱基所占的百分比分别为98.16%和94.30%。

2.2.2 OTUs分析和物种注释

所有样品共注释了41 个门、74 个纲、163 个目、234个科、419个属和146个种。如图1所示，4个组共聚类得到2 538 个OTU，a、b、c、d 组OTU 数分别为1 665、1 627、1 663、1 855 个，共用1 170 个OTU，占OTU总数的46.10%，独有的OTU数分别为75、81、57、430 个，占OTU 总数的比例分别为2.96%、3.19%、2.25%、16.94%，表明a、b、c 组相似度较高，差异较小，d组与其他3组差异较大。

图1 不同试验组粪便微生物Venn图Figure 1 The venn diagram of fecal microorganisms in different groups

2.2.3 菌群α多样性分析

由表4 可知，4 个组的覆盖度均大于0.99，能准确地反映试验羊粪便中细菌的组成。a、b、c组α多样性差异不显著，但随着能氮比降低，Shannon 指数和Simpson指数均呈显著下降趋势（PL<0.05，PQ<0.05），d组的Simpson 指数显著低于a、b 组和c 组（PA<0.05），Shannon指数显著低于b组（PA<0.05）。

表4 不同试验组简州大耳羊菌群多样性指数Table 4 The microbial diversity index of Jianzhou Da′er goats in different groups

2.2.4 菌群β多样性分析

主成分分析（PCA）如图2 所示，主成分1 和主成分2 的贡献值分别为13.15%和7.98%，a、b、c 3 组样本差异较小，微生物群落结构相似度较高，而d 组与其他3组距离较远，差异较大。

图2 粪便微生物主成分分析Figure 2 The principal component analysis（PCA）of fecal microorganisms

2.2.5 粪便菌群在门和属水平上的组成与相对丰度

如表5所示，在门水平上厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidota）是优势菌门，两个菌门占总细菌种类的80%左右。随着饲粮能氮比降低，厚壁菌门的相对丰度先增加后降低（PQ=0.007），c组最高，但与a、b 组差异不显著，d 组显著低于前3 组（PA=0.003）；疣微菌门（Verrucomicrobiota）和放线菌门（Ac⁃tinobacteriota）相对丰度呈线性升高（PL<0.05），且d 组显著高于前3组（PA<0.05）；其他菌群相对丰度没有受到显著影响（P>0.05）。

表5 粪便微生物门水平的相对丰度（%）Table 5 The relative abundance of fecal microflora at phylum level（%）

如表6 所示，在属水平上，拟杆菌属（Bacteroi⁃des）、瘤胃球菌科（UCG-005）、另枝菌属（Alistipes）、理研菌科RC9（Rikenellaceae_RC9）、克里斯滕森菌科R7（Christensenellaceae_R-7）、普雷沃氏菌属（UCG-002）和艾克曼菌属（Akkermansia）等是各组粪便优势菌属。随着饲粮能氮比降低，艾克曼菌属（PL=0.002）和拟杆菌属（PL=0.021）的相对丰度呈线性增加，而且d组艾克曼菌属相对丰度显著高于前3组（PA=0.007）。毛螺菌科（Lachnospiraceae_AC2044_group）的相对丰度先增加后降低，呈显著的二次曲线关系（PQ=0.042）。

表6 粪便微生物属水平相对丰度（%）Table 6 The relative abundance of fecal microflora at genus level（%）

3 讨论

3.1 不同能氮比全价颗粒饲粮对简州大耳羊粪便及氮排泄的影响

与猪和鸡的粪便相比，肉羊粪便呈颗粒状，具有含水率较低及适宜的碳氮比等特点[16-17]，在粪肥还田利用中深受种植业主的喜爱，但由于缺少粪便排泄相关参数指导，粪肥资源化利用效率受到限制。因此，本研究获取了饲粮不同能氮比条件下简州大耳羊的粪便排泄参数，并探索其影响规律和机理。我国肉羊粪便排泄参数相关研究报道较少，李丹阳等[18]研究报道半放牧半舍饲贵州半细毛羊的粪便量、尿液量分别为0.97 kg·d-1·只-1和0.53 L·d-1·只-1，全舍饲湖羊分别为0.99 kg·d-1·只-1和0.56 L·d-1·只-1，略低于本研究结果。宋大利等[19]报道的羊粪便排泄量（1.9 kg·d-1）高于本研究，尿液排泄量（0.6 kg·d-1）略低于本研究。分析原因主要是因为测试羊的品种、饲养方式、饲粮形态都具有较大的差异。本研究结果表明全价颗粒饲粮能氮比对试验羊干物质采食量、粪便和尿液排泄量均无显著影响，原因是肉羊干物质采食量与饲粮原料组成、形态、能量和纤维含量显著相关[20]，本试验中饲粮原料组成、形态以及能量和纤维水平一致，因此4组试验羊干物质采食量无显著差异，而干物质采食量显著影响粪便排泄量[21-22]，因此，粪尿排泄量也无显著差异，这与前人研究结果一致。粪便pH 不仅能反映肠道内环境，而且是影响氨气挥发的关键因素，一般呈中性或者弱碱性，pH 升高将增加氮的损失[23]。目前未见关于肉羊粪便pH 的报道，但有研究显示生猪 粪 便pH 为6.42~7.64[24]，肉 鸡 粪 便pH 为6.15~8.17[25]，肉牛粪便pH 为6.42~6.9[26]，均低于本研究结果。生猪和肉鸡均采用全价精饲粮饲喂，而肉牛采用全混合日粮饲喂，精饲粮的占比较低，因此生猪和肉鸡粪便pH 较肉牛更高，而本研究采用全价颗粒饲粮饲喂，且营养浓度按照肉羊饲养标准的最高生产性能（日增质量200 g）进行配方，营养密度较大，导致粪便中未消化的碱性物质含量较高，而且饲粮能氮比降低，增加了饲粮氮的摄入，导致后肠含氮碱性物质增加，进而造成粪便pH增加。

本研究结果表明，饲粮能氮比降低显著增加了尿氮的排泄，且呈现了显著的线性相关性，但对粪氮排泄量没有显著影响。这与牛骁麟等[27]用蛋白水平分别为11.5%、14.0%和16.5%的饲粮饲喂32.25 kg左右湖羊的研究结果一致，同时，樊艳华等[28]和Marini等[29]也得出了相似的试验结果。粪氮排泄量差异不显著是由于粪氮主要来源于未消化的日粮氮、未被消化的微生物氮和内源氮，排泄量一般比较稳定[30]；尿氮排泄与反刍动物特殊的消化功能有关，研究表明，反刍动物饲粮中的大部分养分在瘤胃被分解消化，饲粮蛋白质被分解为肽、氨基酸和氨，一部分氨被瘤胃微生物利用合成微生物蛋白，另一部分则被瘤胃壁或后肠吸收，通过血液循环经门静脉进入动物肝脏转化为尿素，其中一部分被尿液排出体外，当蛋白质不足时，部分尿素重新进入血液循环到达唾液腺，随唾液重新进入瘤胃[2]。因此，随着能氮比降低，饲粮氮浓度升高，多余的氮以尿素的形式通过尿液排出体外，导致尿液中的氮排泄量增加，而当尿液中尿素排出体外遇到粪便尿素酶时会转化为氨，导致尿总氮和氨氮的量显著增加。而尿氨氮容易挥发，且具有刺激性气味，尿氨氮排泄量的增加不但增加了氮的损失，还会导致圈舍内NH3的浓度增加，影响动物健康。

3.2 不同能氮比全价颗粒饲粮对简州大耳羊粪便微生物区系的影响

16S rRNA 高通量测序技术可以很好地揭示肉羊粪便微生物多样性。Shannon 指数和Simpson 指数可反映菌群的多样性，d 组的Simpson 指数最低，说明粪便菌群的多样性和均匀度低于前3组，这与PCA 结果一致。本研究发现，拟杆菌门和厚壁菌门为试验羊主要优势菌门，这与魏子维等[31]对雷州山羊及潘锋等[32]对肉牛粪便微生物的研究结果一致。本研究结果显示，随着饲粮能氮比降低，d 组的厚壁菌门相对丰度显著降低。研究表明，厚壁菌门主要与碳水化合物和蛋白质的吸收有关[33]，厚壁菌门相对丰度越高，可能越有利于饲粮蛋白质的消化吸收，其相对丰度降低不利于蛋白质的消化吸收。付敏等[3]的研究表明在饲粮能氮比为0.43 时，简州大耳羊生长性能最佳，能氮比为0.35 时，生长性能下降。因此，饲粮能氮比可能会通过影响肉羊后肠菌群的相对丰度，进而影响生长性能。与此同时，本试验结果显示，当饲粮能氮比为0.35 时，疣微菌门和放线菌门的相对丰度显著增加，而疣微菌门具有诱导和调节免疫的能力[34]，放线菌主要通过产生多种抗生素消灭致病菌群来保护宿主，部分放线菌还能分泌蛋白酶等帮助宿主消化分解饲粮营养物质[35]，由此推断，在能氮比降低到0.35时，肉羊后肠可能存在潜在的健康问题，诱导了机体产生免疫反应，同时分泌抗生素抵抗致病菌。研究表明，拟杆菌属能产生纤维素酶，提高动物对饲粮的消化吸收[36]，在属水平上，本研究最主要的优势菌是拟杆菌属，说明后肠仍然具有较多的待消化养分，需要微生物分泌更多酶帮助消化。本试验中，饲粮能氮比降为0.35 时，艾克曼菌属的相对丰度显著提高，研究认为艾克曼菌可以改善肠道屏障功能、增厚黏膜层，其数量的增加有助于缓解炎症性肠病症状[37]，因此，饲粮能氮比过低可能增加了后肠的消化负担，可能导致后肠黏膜炎症。

4 结论

（1）饲粮能氮比对试验羊粪便和尿液排泄参数无显著影响。

（2）随着饲粮能氮比降低，粪便pH和尿氮排泄量显著提高。

（3）饲粮能氮比降低到0.35 时，粪便菌群的多样性和相对丰度受到显著影响，粪便菌群的结构发生改变，不利于动物对养分消化吸收，进而影响动物肠道健康。