UHPLC-MS/MS和GC-MS/MS测定甜菜中523种农药及代谢物的残留量

原海越，史小萌，李备，王雯雯，刘潇威，贺泽英*

（1.海南省食品检验检测中心，国家市场监管重点实验室（热带果蔬质量与安全），海口 570311；2.农业农村部环境保护科研监测所，天津 300191；3.安捷伦科技有限公司，北京 100102）

甜菜（Beta vulgaris L.）作为重要的糖料作物，在我国北方种植已有100 多年的历史[1]。甜菜中具有甜菜碱和甜菜纤维等营养物质，同时也具有一定的药用价值[2]。但为了防治甜菜生长过程中的病虫草害，农药的使用是必不可少的，但农药残留量含量超标最终会影响消费者的健康[3]。许多国际组织和国家（如中国、美国和日本）的法规均规定了农药在植物源性等食品中的最大残留限量（MRL）。我国最新制定的最大残留限量标准GB 2763—2021 将甜菜中的大部分农药残留水平设定为0.01~0.5 mg·kg-1。甜菜中的农药残留检测对于确保食品安全和遵循生产质量管理规范都非常重要。

当前最常用农药多残留检测手段基于色谱串联质谱。如四极离子阱QqLIT[4]、静电轨道阱Obritrap[5]和飞行时间TOF[6]，可用于复杂基质中农药多残留的高通量分析，其中最常用的质谱检测器为三重四极杆（QQQ），大量文献表明使用色谱串联三重四极杆质谱建立果蔬等农产品中几百种农药的残留检测方法是可行的。目前针对甜菜中的农药残留分析检测报道较少，仅知甜菜安（desmedipham）和甜菜宁（phenmedipham）在甜菜中有方法开发及相应的残留检出[7]，因此本研究建立一种甜菜中农药多残留检测方法具有实际意义。

针对前处理的提取技术，QuEChERS 方法是目前前处理最常用的手段，其中经常使用到的净化材料有十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅胶（PSA）和石墨化炭黑（GCB），其中PSA 可以净化乙腈提取液中的糖类、酸性物质等极性干扰物，但其在净化基质的同时可能对一些化学性质的农药具有吸附作用[8]，造成回收率降低。文献中鲜有PSA 对农药吸附的报道。因此，系统考察PSA吸附的影响是非常必要的。

基于以上所述，该文采用UHPLC-ESI-MS/MS 和GC-EI-MS/MS 联合建立甜菜中523 种农药及代谢物的多残留检测方法，同时优化前处理过程中PSA的使用量，考察两种检测仪的性能、回收率和定量限（LOQ）及线性和基质效应等，以期为甜菜中农药多残留检测提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

液质分析采用UHPLC 系统串联三重四极杆-线性离子阱质谱（QTRAP 5500+，SCIEX）。气质分析采用气相色谱-串联三重四极杆质谱（GC-EI-MS/MS）（7000 D，Agilent，美国）。

甲醇、乙腈和乙酸乙酯（HPLC 级），购自飞世尔科学公司（Fair Lawn，美国）；甲酸（纯度≥99%）和甲酸铵（纯度≥99%）来自阿拉丁生化技术有限公司（上海）；水，通过Milli-Q系统（Millipore，美国）纯化。

农药标准品，由农业农村部环境保护科研监测所提供。用丙酮配制10 mg·L-1混合标准溶液，-20 ℃储存，备用。

QuEChERS 提取盐包（Bond Elut QuEChERS P-N 5982-5650：4 g 无水硫酸镁，1 g 柠檬酸钠二水合物，0.5 g柠檬酸二钠盐倍半水合物，1 g氯化钠）和分散固相萃取吸附剂PSA，购自安捷伦科技公司（美国）。

1.2 样品前处理

选择空白甜菜样品进行预分析，以确保不存在目标分析农药，进行后续方法学考察。

实际样品采用本实验室之前研究中开发的QuEChERS 方法制备[9]。称取10 g 试样（精确至0.01 g）放入50 mL的聚丙烯离心管中。然后加入10 mL的乙腈、陶瓷质子和上述QuEChERS提取盐包。密封试管，手动用力振荡1 min，之后4 200 r·min-1离心5 min。离心后，取6 mL 上清液到15 mL 聚丙烯离心管中，其中含有900 mg 无水MgSO4、150 mg PSA。涡旋混匀1 min，离心机4 200 r·min-1离心5 min。取上清液1 mL 过PTFE 微孔滤膜（0.22 μm）过滤后进行UH⁃PLC-MS/MS 分析。取2 mL 上清液于10 mL 的玻璃管中，40 ℃水浴中氮气吹至近干，加入20 μL 的内标1 mg·L-1环氧七氯B 溶液，再加入1 mL 乙酸乙酯复溶，过PTFE微孔滤膜（0.22 μm）后进行GC-MS/MS分析。

1.3 色谱质谱检测条件

1.3.1 UHPLC-ESI-MS/MS

LC 检测条件：使用C18 色谱柱（HSS T3 柱，2.1×100 mm，1.7 μm，Waters，美国）进行色谱分离；柱温设置为40 ℃，流动相A 为水、流动相B 为甲醇，均含2 mmol·L-1甲酸铵和0.01%甲酸，流速为0.3 mL·min-1，洗脱梯度见表1，进样量为2 μL。

表1 流动相及其梯度条件（VA+VB）Table 1 Mobile phase and gradient conditions（VA+VB）

质谱检测条件：离子源为电喷雾离子源（ESI），扫描方式为正离子和负离子同时扫描，检测方法为多反应监测模式（MRM）。电喷雾电压（ISVF）5 500 V，离子源温度350 ℃，雾化气压力（GS1）3.48×105Pa，加热器气压力（GS2）3.48×105Pa，气帘气压力2.07×105Pa。

1.3.2 GC-EI-MS/MS

气相色谱条件：色谱柱为VF 1701ms 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。以氦气为载气，色谱柱的流速为1 mL·min-1。柱温箱升温程序：初始温度为40 ℃，保持1 min，在以40 ℃·min-1升温到120 ℃，然后以5 ℃·min-1升温到240 ℃，再以12 ℃·min-1升温至300 ℃，保持10 min；在不分流模式下，进样口温度为280 ℃，进样体积为1 μL。

质谱条件：离子源为电子轰击源（EI）；电力电压为70 eV；监测模式为多反应监测模式（MRM）；碰撞气为氮气1.5 mL·min-1；载气为氦气1 mL·min-1，离子源和传输线温度设置为280 ℃。

1.4 方法学考察

根据欧盟指导标准[10]，在优化条件下，根据正确度、精密度、定量限（LOQ）、线性和基质效应5 个方法学指标进行验证。为确定该方法的准确度和精密度，在5 个浓度水平上进行回收率的研究。使用溶剂和甜菜空白基质提取溶液分别配制523 种农药及代谢物的溶剂和基质标准溶液（浓度分别为2、5、10、20、50、100、200 μg·kg-1）进行线性研究，并计算基质效应。方法的LOQ 定义为满足回收率和RSD 要求的最低添加浓度。

1.5 实际甜菜样品农药残留检测

购买市售甜菜样品232 份，匀浆处理后，-20 ℃保存，备用待测。按照1.2 节前处理方法进行样品前处理，采用1.3 节仪器条件进行523 种农药残留的测定。

2 结果与讨论

2.1 PSA含量优化

设置5 个不同水平的PSA 用量，分别为0、5、10、25、50 mg·mL-1，对提取出的空白甜菜基质进行净化处理。其净化效果采用GC-MS/MS 的全扫描模式进行比较。由图1 可见，随着PSA 用量增加，基质净化效果逐渐提高。之后，将5 个不同水平的PSA 用量用于前处理加标提取，GC-EI-MS/MS和LC-ESI-MS/MS检测结果发现在供剂的523 种农药中，随着PSA 使用量的增加，有40 种农药的回收率降低（表2）。其中，多半受影响的是磺酰脲类农药[11]，而且PSA 对异狄氏剂醛吸附非常严重，即使用量为5 mg·mL-1，高浓度添加下回收率仍仅有50%左右，无法满足检测需求。因此，对于异狄氏剂醛，不宜使用PSA进行净化，受影响的39 种农药在PSA 用量为5 mg·mL-1时可以满足回收率在60%~120%之间的要求，其余农药的PSA使用量仍为25 mg·mL-1。

图1 GC-MS/MS全扫描下不同用量PSA对空白基质的净化效果Figure 1 Purification of different dosage of PSA on blank matrix by GC-MS/MS full scan model

表2 不同PSA含量下受PSA影响的农药及其回收率Table 2 Pesticides affected by PSA and their recoveries under different PSA dosage

2.2 色谱和质谱条件

液相和气相色谱条件参数基于GB 23200.121—2021 和GB 23200.113—2018 两项国家标准的要求，农药的MRM 条件除标准中已有的453 种外，对其余70 种进行质谱参数的优化。对于UHPLC-MS/MS，对每种农药进行质谱端的针泵优化，以优化MRM 条件和相应的质谱参数，主要包括去簇电压（DP）和碰撞能量（CE）以及不同的加合方式，即[M+H]+或[M+NH4]+。其中24 种适用于UHPLC-ESI-MS/MS 检测。对于这24 种农药，首先使用溶剂标准溶液优化多个MRM 条件。然后在空白甜菜提取溶液配制的标准溶液中对这些MRM 进行对比，选取两个响应最佳的离子对作为定量和定性离子。对于GC-EI-MS/MS，有45 种农药适用于其检测。首先全扫描确定前体离子碎片和保留时间。然后，用产物离子模式对每种农药进行分析，最终在多个MRM 条件中确定两个最佳的MRM 条件和相应的碰撞能量（CE）。表3 和表4 仅列出新增70种农药的详细色谱和质谱参数，其余453种农药及代谢物的详细条件可参考上述两项标准。

表3 UHPLC-MS/MS分析中农药的保留时间和MRM参数Table 3 Retention time and MRM parameters of pesticides in UHPLC-MS/MS analysis

2.3 仪器方法验证与比较

2.3.1 仪器性能

经过统计筛查，523 种农药，有399 种适合于UH⁃PLC-MS/MS 检测，266 种适合于GC-MS/MS 检测。其中有142种同时适用于两种仪器检测。

2.3.2 回收率和定量限LOQ

回收率在2、5、10、100 μg·kg-1和200 μg·kg-15个不同浓度水平考察，每个添加水平下设置重复组（n=5）来确定方法的准确度和精密度，添加回收样品的真实浓度与空白基质提取液配制已知农药浓度的标准溶液进行比较，计算回收率。每种农药的定量限LOQ根据添加回收试验的回收率和相对标准偏差RSD 确定，根据SANTE 11312/2021 的要求，定量限为回收率和RSD均可接受的最低添加浓度。

UHPLC-MS/MS 和GC-MS/MS 的回收率和RSD在5 个不同添加浓度水平下，GC-MS/MS 检测农药的回收率大部分在80%~100%之间，RSD绝大多数≤10%。除5 μg·kg-1浓度水平条件下UHPLC-MS/MS 检测农药的回收率大部分在60%~80%之间，其他浓度水平下，农药的回收率也大部分在80%~100%之间。同样，绝大多数RSD≤10%。两种检测仪器检测的全部农药 回 收 率 为65.1%~116.4%，RSD≤24.1%，根据SANTE 文件要求绝大多数农药得到了令人满意的回收率和RSD。UHPLC-MS/MS和GC-MS/MS的添加回收试验结果显示523 种农药及代谢物在甜菜中的定量限LOQ 绝大多数为2 μg·kg-1，8 种农药的定量限LOQ 为5 μg·kg-1。该方法523 种农药的定量限LOQ均低于GB 2763—2021 标准中规定的在甜菜中的最大残留限量MRL 值。各项指标等均达到农药残留测定分析的相关标准要求，表明试验所建立的方法可满足在甜菜中的同时残留测定分析需求。

此外，142 种适用于两种仪器检测的农药的回收率和RSD 相比较的结果如图2 所示。结果发现农药的回收率大部分仍然在80%~100%之间。对于RSD，UHPLC-MS/MS的重现性要比GC-MS/MS略好。总体来说，相对于UHPLC-MS/MS，GC-MS/MS 对此142 种农药的检测无明显差异。

图2 142种农药在甜菜中的回收率和RSD分布Figure 2 Recovery and RSD distribution of 142 pesticides in beet

2.3.3 线性和基质效应

以各组分的质量浓度为横坐标，对应峰面积或与内标峰面积的比值为纵坐标，进行回归分析，结果发现，无论采用GC-MS/MS还是UHPLC-MS/MS，所有农药在所设计的浓度范围内均具有良好的线性关系，相关系数均高于0.99，并且，UHPLC-MS/MS 和GC-MS/MS 结果显示的部分相关系数高于0.999，线性关系也无明显差异。

通过比较溶剂和甜菜基质中农药标准曲线的斜率计算基质效应。当基质效应存在时，痕量化合物的定量分析可能会受到影响[12]。一般在GC-EIMS/MS 和LC-ESI-MS/MS 中分别报道基质增强或抑制。51.80%、23.60%和24.60%的目标物在UHPLCMS/MS 分析中分别呈强基质效应（ME≤-50% 或ME≥50%）、中 等 基 质 效 应（-50%≤ME≤-20% 或20%≤ME≤50%）和弱基质效应（-20%≤ME≤20%）。22.20%、21.10%和56.70%的目标物在GC-MS/MS 分析中分别呈强基质效应（ME≤-50%或ME≥50%）、中等基质效应（-50%≤ME≤-20%或20%≤ME≤50%）和弱基质效应（-20%≤ME≤20%）。针对142 种适用于两种仪器检测的农药在UHPLC-MS/MS 分析中多呈强基质效应，而在GC-MS/MS 分析中多呈弱基质效应。由于在GC-MS/MS 和UHPLC-MS/MS 检测结果中显示出部分农药存在较强的基质效应，为最大程度消除基质效应的影响，更大程度保证检测的准确性，在实际样品检测中采用基质匹配标准曲线进行定量分析。

2.4 实际样品测定及分析

用这两种色谱串联质谱的方法对232 份甜菜样品进行了分析，以评价这两种方法在甜菜农药残留检测方面的可靠性。在10 个不同样本中共检出5 种农药残留，具体数据见表5。毒死蜱、马拉硫磷、溴氰菊酯、氰戊菊酯在我国均有登记使用，且为农业生产中常用品种，但除线磷并未在我国登记。在定量方面，3种同时适用于两种仪器检测农药（毒死蜱、溴氰菊酯、氰戊菊酯），其定量结果在两种仪器上结果一致，表明两种检测技术可靠。

表5 实际样品的农药检测Table 5 Pesticide detection of real samples

甜菜样品检测结果显示毒死蜱、马拉硫磷、溴氰菊酯、氰戊菊酯低于GB 2763—2021 标准的MRL值，除线磷未在我国登记因此在GB 2763—2021 标准中未规定MRL 值。其中，毒死蜱检出率为2.16%、除线磷检出率为2.16%、马拉硫磷检出率为0.43%、溴氰菊酯检出率为0.43%、氰戊菊酯检出率为0.43%，232 份样品中的农药残留量未经检测超过我国制定的MRL 值。但根据欧盟限量标准有少量样品中的毒死蜱（5 份）、溴氰菊酯（1 份）和氰戊菊酯（1 份）残留量超标。

3 结论

（1）建立同时检测甜菜中523 种农药及代谢物的QuEChERS 提取结合超高效液相色谱串联质谱法和气相色谱串联质谱的多残留分析方法。523 种农药及代谢物中有399种适合于UHPLC-MS/MS检测、266种适合于GC-MS/MS 检测、142 种同时适用于两种仪器检测。

（2）该方法线性关系良好，添加回收率及其相对标准偏差均在规定范围内，绝大多数农药的LOQ 为2 μg·kg-1、8 种农药的LOQ 为5 μg·kg-1，低于各农药在我国规定的MRL 值，方法性能满足农药残留在农作物中的检测分析要求，说明该方法适用于甜菜中的农药多残留准确定性和定量分析及市场监督抽查等，具有很好的实际应用价值。

（3）实际样品检出未登记农药除线磷，其他农药残留量均低于我国限量标准规定的MRL 值，但部分农药残留量超过欧盟限量值。