重金属和Bt蛋白联合暴露对细菌毒性的影响

高帆帆，王莉，2，杨思培，高榕，2，吴志斌，2，方俊，2，梁运姗，2*

（1.湖南农业大学资源环境学院，洞庭湖区农村生态系统健康湖南省重点实验室，长沙 410128；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南省猪场废弃物无害化处理与资源化利用工程研究中心，长沙 410128）

重金属污染一直受到国际、国内社会的高度关注。重金属沿着食物链，通过生物积累对生物体造成严重的健康威胁[1]。我国南方地区有色金属开采和冶炼活动的快速扩张导致镉、铜及其他金属污染严重，其中稻田镉污染导致稻米中镉含量超过食品安全标准限值[2]。不同重金属种类、有效性、存在形态及含量对生物体产生的毒害效果不同[3-5]。大多数金属阳离子会与蛋白质有效络合，从而形成不同的金属离子-有机络合物[6]，而目前有关金属和其他物质联合暴露对生物体的毒性研究较为匮乏。因此探究重金属与其他物质联合暴露对生物体的毒性，可以更好地了解重金属对生物体的毒性行为。

苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，其分泌的结晶蛋白（如Cry1Ab 和Cry1Ac）可通过复杂的毒性机制控制鳞翅目昆虫[7]。Bt 转基因作物被大规模商业化推广种植，从而导致大量Bt毒素蛋白通过植物根系分泌、秸秆还田和花粉飘落的方式进入土壤和水生生态系统[8-10]，Bt蛋白进入土壤初期会对土壤酶活性产生影响[11]。研究表明Bt毒素进入土壤环境后会与其他污染物，如杀虫剂、抗生素、重金属等相互结合[12-13]。Bt蛋白因富含酸性氨基酸结构而具有较强的金属络合能力，其倾向与过渡金属离子形成复合物[14]，目前关于Bt抗虫蛋白和重金属联合暴露对微生物的毒理作用研究较少。因此，评估两者联合暴露对微生物活性的影响具有重要意义[15]。

本研究以Cry1Ac 蛋白作为Bt 蛋白代表，以Zn2+、Cd2+作为重金属代表，以大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为受试模式生物，分析Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白单独及联合暴露对两种细菌的毒性作用，以期为重金属与Bt 毒素联合暴露对微生物的生态安全风险进行有效评估。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养基配制

1.1.1 菌种来源

大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Ba⁃cillus subtilis）由湖南农业大学微生物实验室提供；发光细菌为费氏弧菌（Vibrio fischeri），购自浙江清华长三角研究院。

1.1.2 LB培养基

液体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、超纯水1 L、121 ℃灭菌25 min。

固体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、超纯水1 L、加入1.5%琼脂、121 ℃灭菌25 min。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌的生长曲线实验

将1 mL 不同浓度的Zn2+、Cd2+、Cry1Ac 蛋白单一及复合体系分别与1 mL 菌悬液和8 mL 液体培养基混合，最终Zn2+浓度为2、4、8、12、16、20 μg∙mL-1，Cd2+浓度为2、4、6、8、10 μg∙mL-1，Cry1Ac 蛋白浓度为0.2、0.8、1、2、4 μg∙mL-1，复合体系的浓度配比为1∶1，浓度为0.2、1、2、4 μg∙mL-1，培养24 h。不添加Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白的对照组加入1 mL蒸馏水。

B2C企业技术能力包括核心技术水平和技术创新能力两个方面。核心技术水平主要由信息技术水平和物流技术水平等构成。信息技术水平指B2C企业的网站系统建设、信息化水平的建设等；物流技术能力是指物流软技术，包括系统工程技术、价值工程技术、配送技术等。技术创新能力是引领市场需求、减少成本、增大企业市场规模的物质基础，B2C企业的信息技术和物流技术的学习创新在优化企业产品/服务组合、降低企业成本、提升企业主营业务的异质性、独特性方面发挥重要作用。

1.2.2 平板计数

在固体LB 培养基中分别加入不同浓度的Zn2+、Cd2+及Zn2+-Cry1Ac、Cd2+-Cry1Ac 复合体系（Zn2+：4、8、12、16、20 μg∙mL-1；Cd2+：2、4、6、8、10 μg∙mL-1；复合体系：2、4 μg∙mL-1）溶液，将对数期的E.coli和B.subti⁃lis 菌液稀释6 倍，分别取100 μL 均匀涂布于各平板上，在37 ℃恒温培养12 h 后进行活菌计数。以不添加Zn2+、Cd2+和Cry1Ac 蛋白培养的细菌菌落数作为对照活菌数（CK），用平板计数器对活菌进行计数，记录各平板上的菌落数，选取菌落数在30~300 个之间的平板用于计算，求出同一处理组平板上生长的平均菌落数。由公式（1）计算存活率：1.2.3 细菌活性氧测定

按照1.2.2的步骤收集处理后的E.coli和B.subtilis菌液至50 mL离心管，6 000 r∙min-1离心10 min；用pH为7.02 的PBS 缓冲液洗涤，6 000 r∙min-1离心5 min，涡旋去除残留；取10 μL 的活性氧（ROS）荧光探针（浓度为10 mol ∙L-1的DCFH-DA）工作液染色30 min，避光37 ℃孵育30 min，每隔10 min 轻轻摇动；孵育结束用磷酸盐缓冲液充分洗涤；用酶标仪在发射波长530 nm处检测样品的荧光强度。

1.2.4 急性毒性实验

在超净无菌工作台内将-20 ℃保存的Vibrio fisch⁃eri 冻干粉西林瓶打开，取复苏液1 mL 于室温下平衡复苏10 min，振荡摇匀。吸取发光菌液1 mL，用2%NaCl 稀释至40 mL。将不同浓度样品（Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白和复合体系）溶液放在96孔板中，不同物质每个浓度设置3 个平行，第一行设置为阴性质控（2%NaCl），为初始发光强度，第二行为阳性质控（10 mg∙L-1的ZnSO4溶液），为样品发光强度。各孔中加入样品液180 μL 和发光菌液20 μL，总体积200 μL，15 min 后放入检测仪测定发光强度。根据Vibrio fischeri的荧光强度计算抑制率（RI，%），计算公式如下：

式中：C0为阴性质控初始发光强度；St为t时样品的发光强度。

1.3 数据处理

每个实验设置3 个重复，采用SPSS 22 进行分析，采用单因素方差分析（ANOVA）和最小显著性差异（LSD）检验差异的显著性，采用Origin 9绘图。

2 结果与讨论

2.1 不同浓度Zn2+、Cd2+对细菌生长曲线的影响

重金属对细菌生长会产生抑制作用，浓度愈高抑制作用愈强[16]。Zn2+、Cd2+浓度增加对B.subtilis 和E.coli 的抑制增强（图1），E.coli 细胞壁具有带负电荷的脂多糖，其可与更多的金属阳离子结合[17-18]，B.subtilis耐性强于E.coli。不同金属对生物体的毒性不同，Cd2+对B.subtilis 和E.coli生长的抑制作用大于Zn2+。Cd 是强毒性元素，低浓度就有很强的毒性；Zn 是生物体必需元素，低浓度Zn 可保护细胞免受伤害[19]。Zn2+和Cd2+的加入均对两种细菌产生了不同程度的毒害，如图1 所示，Cd2+对两种细菌的生长抑制效果强于Zn2+。不同浓度的Zn2+和Cd2+胁迫培养细菌生长0~24 h 时，OD 值均低于对照组。随着金属浓度的增加，0~11 h 为B.subtilis 的生长期，此时生长曲线呈快速生长趋势，吸光值增大，12~15 h 处于稳定期，15 h 以后OD 值减弱，此时为衰亡期。Zn2+和Cd2+浓度分别在20 μg∙mL-1和8 μg∙mL-1时完全抑制E.coli生长。

图1 不同浓度Zn2+、Cd2+对细菌生长曲线的影响Figure 1 Effects of different concentrations of metal ions on bacterial growth curve

2.2 Cry1Ac 蛋白及其与Zn2+、Cd2+联合暴露对细菌生长曲线的影响

图2 为Cry1Ac 蛋白及其与Zn2+、Cd2+联合暴露条件下的细菌生长曲线。在0~16 h，各处理组细菌生长曲线的OD600值均低于对照组。在0~10 h 内细菌处于生长期，Cry1Ac 蛋白和Zn2+-Cry1Ac、Cd2+-Cry1Ac 联合暴露对B.subtilis 和E.coli 生长产生抑制，且随浓度增加细菌生长受到的抑制作用增强，且E.coli 比B.subtilis 更为敏感。Cd2+单独及复合体系对两种细菌的毒性明显强于Zn2+单独及其复合体系，Zn在短期内的毒性可能与生物体内贮存浓度有关，当Zn 在生物体内积累到一定浓度就会启动金属硫蛋白，促使其与金属硫蛋白结合而降低毒性[20]。同时Zn2+和Cd2+都会与Cry1Ac 蛋白结合，从而减轻重金属对细菌的毒害[21]。

2.3 Cry1Ac 蛋白及其与Zn2+、Cd2+联合暴露下菌落平板生长状况观察

采用平板计数法检测Zn2+、Cd2+及Cry1Ac 蛋白联合暴露时对E.coli和B.subtilis存活的影响，结果如图3所示。随着重金属浓度的增加，细菌的存活率显著降低（P<0.05）。重金属会抑制细菌酶活性及其生长，高浓度重金属甚至会导致细菌死亡[22]。Cd2+浓度为10 μg∙mL-1时E.coli和B.subtilis的存活率均为0，表明Cd2+浓度为10 μg∙mL-1时对两种细菌的抑制率达到最大。当Zn2+浓度为16 μg∙mL-1时，E.coli 的存活率为0，Zn2+浓度为20 μg∙mL-1时，B.subtilis 的存活率为0，表明Zn2+浓度为16、20 μg∙mL-1时分别对两种细菌抑制率达到最大。当Zn2+-Cry1Ac 的浓度为4 μg∙mL-1时，对E.coli 和B.subtilis 的存活率分别为74.7%和76.8%，当Cd2+-Cry1Ac浓度为4 μg∙mL-1时，E.coli和B.subtilis的存活率分别为66.1%和71.2%，即Cd2+-Cry1Ac对两种细菌生长的抑制效果强于Zn2+-Cry1Ac。

图3 不同浓度Zn2+、Cd2+及其与Cry1Ac蛋白联合处理的细菌存活菌落电镜图Figure 3 Electron microscopic images of different concentrations of Zn2+，Cd2+and their combined with Cry1Ac protein against bacteria

2.4 细菌ROS活性检测

过量ROS 会造成细菌氧化损伤，甚至使细菌活性受到影响[23]。重金属氧化损伤所产生的ROS 可攻击膜脂，导致膜功能障碍，同时对蛋白质、DNA 和细胞内系统造成损害。图4 为暴露于Zn2+和Cd2+后细菌体内的ROS 产生量变化。单一金属对细菌毒性影响的结果表明：Zn2+浓度从2 μg∙mL-1增加到20 μg∙mL-1，E.coli 和B.subtilisti 产生的ROS 变化显著（P<0.05）。Zn在酶催化反应、细胞代谢、信号传递等生理调节过程中发挥重要作用，有助于抑制自由基和ROS的产生，从而可增强蛋白质的稳定性和抗氧化酶的活性[24]。然而过量的Zn 会起到毒性作用，Zn 会与其他金属发生错金属化阻断蛋白质硫醇表达，从而引发基本生物功能的破坏，导致细胞毒性[25]。Cd2+浓度从2 μg∙mL-1增加到10 μg∙mL-1，E.coli 和B.subtilisti 产生的ROS 变化显著（P<0.05），虽然Cd2+浓度低，但其毒性很高[20]。Cd2+浓度的增加会诱导细菌产生过量的ROS，造成DNA 损伤，最后使生物体发生细胞凋亡[26]。此外，细胞内ROS 产生量的增加可能与金属引起的抗氧化剂消耗（如谷胱甘肽）有关[27]。直接影响重金属对生物体毒性效应的不是吸附金属离子的数量，而是能够与酶、蛋白质、DNA 以及其他细胞结构的功能基团反应的离子或分子的数量[28-30]。

图4 Zn2+和Cd2+对两种细菌ROS产生量的影响Figure 4 Effects of Zn2+and Cd2+on ROS production of two kinds of bacteria

细菌处于Zn2+、Cd2+和Cry1Ac 蛋白联合暴露的条件下时，随着浓度增加两种菌体ROS 的产生量整体呈现先上升后降低趋势（图5），各处理组细菌ROS 产生量都低于对照组（除了浓度为2 μg∙mL-1的Zn2+-Cry1Ac复合体对E.coli的ROS产生量为103.1%）。如图5 所示，联合暴露下E.coli 和B.subtilis 的ROS 产生量呈显著性变化（P<0.05），这与单独金属离子暴露下细菌ROS 产生量呈现的趋势不同，是与金属离子与色氨酸的吲哚基团之间的N 配位有关。在Zn2+-Cry1Ac和Cd2+-Cry1Ac体系中，Zn2+和Cd2+对吲哚基团（色氨酸）中的N具有很强的结合能力，导致其对细菌的氧化损伤降低，从而进一步降低金属毒性[31]。Zn2+-Cry1Ac 处理比Cd2+-Cry1Ac 处理下E.coli 体内ROS 产生量多：一方面，Cd2+会诱导细菌防御机制响应诱导谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和金属硫蛋白（MT）等几种保护酶的升高，这些酶能够拮抗Cd 的毒性，更多的抗氧化酶能够清除生物体中Cd胁迫产生的超氧阴离子和过氧化氢等[7]。另一方面，用纯Cd2+溶液（如CdCl2）进行培养时，其对细菌的毒性大于Zn2+溶液。Cd2+-Cry1Ac 较Zn2+-Cry1A对细菌的毒性低，这是因为Cd2+与其他物质（例如各种离子或有机成分）之间的相互作用通常会改变Cd2+的毒性，此时Zn2+-Cry1A 联合暴露对细菌毒性更强[20]。

图5 Zn2+、Cd2+和Cry1Ac蛋白联合暴露对两种细菌ROS产生量的影响Figure 5 Effects of combined exposure of Zn2+，Cd2+and Cry1Ac protein binary systems on ROS production of the two bacteria

2.5 发光细菌急性毒性检验

发光细菌的发光抑制率反映重金属对细菌的毒性效应。有研究发现Zn 浓度大于1.2 mg∙L-1时对发光细菌的发光强度有明显抑制作用，Cd 和Pb 浓度改变对发光强度的影响不显著[32]。如图6 所示，不同浓度Zn2+、Cd2+均对Vibrio fischeri 产生抑制，且抑制率随金属浓度增加而变大（P<0.05）。Zn2+浓度从2 μg∙mL-1增加到20 μg∙mL-1，Zn2+对Vibrio fischeri的发光抑制率由41%增加到85%；Cd2+浓度从2 μg∙mL-1增加到10 μg∙mL-1，Cd2+对Vibrio fischeri 的发光抑制率由39%增加到61%；即不同浓度金属离子的毒性效果不同，浓度愈高，毒性愈强。相同浓度下Zn2+对Vibrio fischeri的抑制率大于Cd2+，即Zn2+对Vibrio fischeri的毒性较大。青海弧菌Q67 和费氏弧菌的毒性实验结果也表明Zn2+的毒性大于Cd2+，可能是Zn2+与硫的亲和力强于Cd2+，导致其对发光细菌毒性较大[33]。

图6 不同浓度Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白及复合体系对费氏弧菌生长抑制率的影响曲线Figure 6 Influence curves of different concentrations of Zn2+，Cd2+，Cry1Ac proteins and their complex systems on growth inhibition rate of Vibrio fischeri

从图6（c）中可以看出，各处理对细菌作用15 min后，随着Cry1Ac 蛋白浓度升高，Vibrio fischeri 的发光抑制率由负到正，这是由于Cry1Ac 蛋白本身含有具有内源荧光特性的色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr），其中最主要的是色氨酸[34-35]。具有荧光特性的Cry1Ac 蛋白与Vibrio fischeri 结合导致荧光强度增强，因此抑制率为负，随着Cry1Ac 蛋白浓度的增加，抑制率逐渐增大，但不会对细菌造成毒性影响。研究发现，转基因Bt 稻草（Cry1Ab 蛋白）在淹水条件下分解的Cry1Ab 蛋白对细菌不会造成毒害作用，即Bt蛋白不会对土壤微生物构成危害[15，36]。

Zn2+、Cd2+与Cry1Ac 联合暴露下Vibrio fischeri 的生长抑制率也由负到正，这是由于发出荧光的Cry1Ac 蛋白和Zn2+、Cd2+结合使自身荧光强度有所减弱。研究表明，具有荧光特性的Cry1Ac 蛋白与不发光的金属离子相互作用，降低了Vibrio fischeri 产生的荧光强度[37]，这与本实验的结果一致。仇爱锋等[38]的研究表明随着Cd2+和Cu2+对费氏弧菌暴露时间的延长，菌体细胞膜通透性增强，毒性增大。本研究中，随着浓度的升高各处理对Vibrio fischeri 的抑制效果增强，相同浓度下各处理对Vibrio fischeri 的抑制效果 表 现 为 Zn2+>Cd2+>Zn2+-Cry1Ac>Cd2+-Cry1Ac>Cry1Ac。

3 结论

（1）高浓度的Zn2+、Cd2+会对E.coli、B.subtilis 生长产生抑制作用，细菌存活率也显著降低（P<0.05），两种细菌相比B.subtilis的耐受性强于E.coli。

（2）Cry1Ac 蛋白不会对细菌造成毒性损伤；二元体系联合暴露时Zn2+、Cd2+均与Cry1Ac 蛋白（吲哚基团）结合，使得Zn2+、Cd2+对两种细菌的毒性降低。

（3）两种细菌活性氧产生量表明Zn2+和Cd2+对E.coli 和B.subtilis 造 成 了 严 重 损 伤，Zn2+-Cry1Ac 和Cd2+-Cry1Ac 联合暴露对E.coli 和B.subtilis 没有造成严重损伤。

（4）Zn2+、Cd2+及Cry1Ac 蛋白浓度增加对Vibrio fischeri的发光强度抑制增强，相同浓度下各处理体系的发光抑制效果为Zn2+>Cd2+>Zn2+-Cry1Ac>Cd2+-Cry1Ac>Cry1Ac。