上调LncRNA FEZF1-AS1通过miR-363-3p/Sphk2信号轴促进宫颈癌细胞的机制

刘俊丽 张竣 贺清波 张秀珍 孙萍 胡晓君

宫颈癌是常见的女性恶性肿瘤[1]。早期筛查使患者发病率和死亡率减少[1]。然而,宫颈癌转移直接对受影响的患者生存产生负面影响,但其潜在的分子机制仍不清楚,因此探讨宫颈癌发病机制具有重要意义。长链非编码RNA (LncRNAs)是一组内源性非编码转录本,长度>200个核苷酸,LncRNA参与了不同的细胞过程[2]。已经证明LncRNA的异常表达与人类疾病相关[3]。研究发现LncRNA FEZF1-AS1在肿瘤增殖及转移等过程中发挥重要作用,如LncRNA FEZF1-AS1通过miR-34a促进非小细胞肺癌的侵袭[4]。还有文献报道LncRNA-FEZF1-AS1通过调节PKM2通路促进结直肠癌肿瘤的增殖[5]。提示FEZF1-AS1的异常表达可能是预测癌症转移和预后的分子标记。本研究探讨LncRNA FEZF1-AS1对Hela细胞增殖、侵袭及上皮间质转化(EMT)的影响,阐明宫颈癌的致病机制。

1 材料与方法

1.1 材料 选取我院45例宫颈癌组织和35例癌旁正常组织标本,保存在液氮中。宫颈癌Hela细胞和人宫颈上皮细胞H8细胞来自中国科学院上海细胞库。DMEM培养基、胰蛋白酶为美国Gibco公司产品。MTT检测试剂盒、GAPDH抗体来自上海碧云天生物科技有限公司。FEZF1-AS1 siRNA、pcDNA-FEZF1-AS1、Sphk2 siRNA等质粒来自北京擎科生物公司,miR-363-3p抑制剂(miR-363-3p inhibitor)、miR-363-3p模拟物(miR-363-3p mimics)来自Genepharma公司。E-cadherin、N-cadherin抗体购自英国Abcam。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:Hela和H8细胞在含10%FBS的新鲜DMEM培养基中培养,添加100 U/L的青霉素和链霉素,放在37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中。

1.2.2 细胞转染:Hela细胞铺于12孔板,观察密度约70%时,添加无血清DMEM培养基,取Turbofect转染试剂、重组质粒进行转染,细胞培养板放在37℃、5% CO2培养箱中,48 h后收集细胞进行后续实验。

1.2.3 细胞活力测定:Hela细胞接种至96孔板12 h后用Turbofect进行转染,48 h后弃培养基,加入100 μl PBS洗涤,加入20 μl浓度为5 mg/ml的 MTT, 4 h后将150 μl DMSO加入每孔细胞,摇动10 min,读取570 nm处的吸光度。

1.2.4 双荧光素酶报告基因活性检测:预测LncRNA FEZF1-AS1及其miR-363-3p的靶基因,扩增全长后,构建LncRNA FEZF1-AS1 wt载体和Sphk2 wt载体,点突变试剂盒将野生型质粒进行点突变,命名为LncRNA FEZF1-AS1 mut和Sphk2 mut。按照Turbofect转染说明书将LncRNA FEZF1-AS1 wt、LncRNA FEZF1-AS1 mut分别与miR-363-3p mimics、mimics NC,Sphk2 wt、Sphk2 mut分别与miR-199a-5p mimics、mimics NC共转染至Hela细胞,用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.2.5 细胞侵袭实验:Transwell上室中加入200 μl稀释的 Matrigel 基质,静置12 h。Hela细胞接种于12孔板,并进行转染,将1×105个(200 μl)重悬的细胞悬液加入上室,下室加入400 μl DMEM培养基,24 h后加入PBS清洗,4%多聚甲醛固定,PBS洗涤,新鲜的0.1%结晶紫染色浸染15 min,观察细胞侵袭情况。

1.2.6 实时定量PCR:Trizol试剂加入收取的细胞RNA中,Trizol法提取总RNA,测定浓度及纯度。逆转录试剂盒逆转录细胞总RNA为cDNA,进行RT-qPCR,SYBR Green法分析基因表达量。见表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western blot:细胞蛋白样中加入RIPA裂解液裂解30 min,BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度,10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,再湿转到PVDF膜上;与5% 脱脂奶粉封闭2 h后分别与特异性一抗孵育过夜,TBST洗3次,加入二抗后孵育1.5 h,蛋白曝光后通过Image J 灰度分析。

2 结果

2.1 下调LncRNA FEZF1-AS1抑制Hela细胞增殖、侵袭及EMT RT-qPCR结果显示,宫颈癌组织中LncRNA FEZF1-AS1表达(1.89±0.32)高于癌旁正常组织(1.05±0.54);Hela细胞中LncRNA FEZF1-AS1表达(1.89±0.32)高于H8细胞(1.05±0.54)(P<0.01)。LncRNA FEZF1-AS1 siRNA细胞内FEZF1-AS1表达明显低于siRNA NC组(P<0.01)。FEZF1-AS1 siRNA组细胞活力、侵袭数目、N-cadherin表达低于siRNA NC组(P<0.05),E-cadherin表达高于siRNA NC组(P<0.01)。见图1,表2。

图1 下调LncRNA FEZF1-AS1抑制Hela细胞侵袭及EMT;A Transwell检测Hela细胞侵袭情况(结晶紫染色×200);B Western blot检测Hela细胞EMT

表2 FEZF1-AS1表达、Hela细胞活力、侵袭数目与EMT相关蛋白表达

2.2 LncRNA FEZF1-AS1与miR-363-3p之间的关系 软件预测的FEZF1-AS1和miR-363-3p之间的结合位点。与FEZF1-AS1 wt+mimics NC组相比,FEZF1-AS1 wt+miR-363-3p mimics组荧光素酶活性降低(P<0.01);与FEZF1-AS1 mut+mimics NC组相比,FEZF1-AS1 mut+miR-363-3p mimics组荧光素酶活性无明显化(P>0.05)。见表3,图2。

图2 LncRNA FEZF1-AS1与miR-363-3p之间的结合位点预测

表3 双荧光素酶活性

2.3 下调miR-363-3p促进Hela细胞增殖、侵袭及EMT RT-qPCR结果显示,宫颈癌组织miR-363-3p表达(0.57±0.26)低于癌旁正常组织(1.13±0.52)(P<0.05);Hela细胞中miR-363-3p表达(0.43±0.38)低于H8细胞(1.09±0.42)(P<0.01)。miR-363-3p inhibitor组细胞内miR-363-3p表达明显低于inhibitor NC组,差异有统计学意义(P<0.01)。miR-363-3p inhibitor组细胞活力、侵袭数目、N-cadherin表达高于inhibitor NC组(P<0.05),E-cadherin表达低于inhibitor NC组(P<0.01)。见图3,表4。

图3 下调miR-363-3p促进Hela细胞侵袭及EMT;A Transwell检测Hela细胞侵袭情况(结晶紫染色×200);B Western blot检测Hela细胞EMT

表4 miR-363-3p表达、Hela细胞活力、侵袭数目与EMT相关蛋白表达

2.4 miR-363-3p与Sphk2之间的关系 TargetScan预测的miR-363-3p与Sphk2的结合位点。与 Sphk2 wt+mimics NC组相比,Sphk2 wt+miR-363-3p mimics组荧光素酶活性降低(P<0.01);与Sphk2 mut+mimics NC组相比,Sphk2 mut+miR-363-3p mimics组荧光素酶活性无明显变化(P>0.05)。见表5,图4。

图4 miR-363-3p与Sphk2之间的结合位点预测

表5 双荧光素酶活性

2.5 上调LncRNA FEZF1-AS1通过miR-363-3p促进Hela细胞增殖、侵袭及EMT 与pcDNA-3.1(+)+mimics NC组相比,pcDNA-FEZF1-AS1+mimics NC组细胞活力、侵袭数目、N-cadherin表达升高(P<0.05),E-cadherin表达下降(P<0.01);pcDNA-3.1(+)+miR-363-3p mimics组细胞活力侵袭数目、N-cadherin表达降低(P<0.01),E-cadherin表达升高(P<0.01)。与pcDNA-3.1(+)+miR-363-3p mimics组相比,pcDNA-FEZF1-AS1+miR-363-3p mimics组细胞活力侵袭数目、N-cadherin表达升高(P<0.01),E-cadherin表达下降(P<0.01)。见表6,图5。

图5 上调LncRNA FEZF1-AS1通过miR-363-3p促进Hela细胞增殖、侵袭及EMT;A Transwell检测Hela细胞侵袭情况(结晶紫染色×200);B Western blot检测Hela细胞EMT;a pcDNA-3.1(+)+mimics NC组;b pcDNA-FEZF1-AS1+mimics NC组;c pcDNA-3.1(+)+miR-363-3p mimics组;d pcDNA-FEZF1-AS1+miR-363-3p mimics组

表6 Hela细胞活力、侵袭数目与EMT相关蛋白表达

2.6 下调Sphk2对Hela细胞的增殖、侵袭及EMT的影响 RT-qPCR结果显示,宫颈癌组织中Sphk2表达(1.97±0.33)高于癌旁正常组织(1.04±0.62)(P<0.01);Hela细胞中Sphk2表达(2.03±0.35)高于H8细胞(1.07±0.46)(P<0.01)。Sphk2 siRNA组细胞内Sphk2表达明显低于siRNA NC组(P<0.01)。Sphk2 siRNA组细胞活力、侵袭数目、N-cadherin表达低于siRNA NC组(P<0.01),E-cadherin表达高于siRNA NC组(P<0.01)。见图6,表7。

图6 下调Sphk2抑制Hela细胞侵袭及EMT;A Transwell检测Hela细胞侵袭情况(结晶紫染色×200);B Western blot检测Hela细胞EMT

表7 Sphk2表达、Hela细胞活力、侵袭数目与EMT相关蛋白表达

2.7 LncRNA FEZF1-AS1通过miR-363-3p上调Sphk2表达 FEZF1-AS1 siRNA+inhibitor NC组的Sphk2基因及蛋白表达低于siRNA NC+inhibitor NC组,siRNA NC+miR-363-3p inhibitor 组的Sphk2基因及蛋白表达高于siRNA NC+inhibitor NC组,差异有统计学意义(P<0.01)。FEZF1-AS1 siRNA+miR-363-3p inhibitor组Sphk2 基因及蛋白表达低于siRNA NC+miR-363-3p inhibitor组,差异有统计学意义(P<0.01)。见表8,图7。

图7 Western blot检测Sphk2蛋白表达;a siRNA NC+inhibitor NC组;b:FEZF1-AS1 siRNA+inhibitor NC组;c siRNA NC+miR-363-3p inhibitor 组;d FEZF1-AS1 siRNA+miR-363-3p inhibitor组

表8 Sphk2基因与蛋白表达

3 讨论

研究表明一些LncRNA的失调已经在各种类型的癌症中出现,包括宫颈癌[6]。研究发现LncRNA在宫颈癌的发展过程中发挥作用,如LncRNA TUG1促进宫颈癌细胞生长和EMT[7]。上调LncRNA PANDAR可预测宫颈癌预后不良[8]。目前有文献报道LncRNA FEZF1-AS1参与了如非小细胞肺癌、膀胱癌、胃癌等癌症的增殖及其转移过程[9,10]。在宫颈癌Hela细胞中,我们选择并关注LncRNAFEZF1-AS1,我们首次评估FEZF1-AS1在宫颈癌组织和Hela细胞中的表达。本研究发现FEZF1-AS1在宫颈癌组织中表达增多,此外,RT-qPCR结果显示Hela细胞中FEZF1-AS1表达也明显高于H8细胞。提示FEZF1-AS1可作为预测宫颈癌发生及预后不良的指标。

为了强调FEZF1-AS1在宫颈癌Hela细胞中的上调作用,我们通过功能丧失和功能上调实验进一步探讨了FEZF1-AS1在宫颈癌进展中的关键作用。结果显示,siRNA降低FEZF1-AS1表达显著抑制Hela细胞增殖、侵袭和EMT。而FEZF1-AS1过表达可促进宫颈癌细胞增殖、侵袭和EMT。综上所述,FEZF1-AS1可能是一种致癌基因,在宫颈癌发展中起促进作用。LncRNA FEZF1-AS1参与了多种肿瘤的发展。因此,在癌症中有效阻断这些LncRNA可能是一种新的预防和治疗策略。

LncRNA在人类癌症中的重要性可能与它们通过各种机制影响细胞功能的能力有关。LncRNA的作用机制部分取决于其基因组位置,可能通过miRNA参与癌症发展过程。我们通过生物信息学软件预测发现LncRNA FEZF1-AS1与miR-363-3p具有靶向作用。因此,我们推测LncRNA FEZF1-AS1可能调控miR-363-3p参与宫颈癌的进展。miR-363-3p在癌症中的作用已被广泛报道[11-13],进一步实验发现,敲低miR-363-3p促进Hela细胞增殖、侵袭和EMT。本结果与miR-363-3p在其他癌症中发挥的作用一致,能够作为抑癌基因调控癌症发展。另外,发现上调LncRNA FEZF1-AS1通过miR-363-3p促进Hela细胞增殖、侵袭及EMT,也进一步证明了我们的猜想。后续实验发现miR-363-3p靶向Sphk2,此外,我们验证了干扰Sphk2表达也能抑制Hela细胞增殖、侵袭和EMT,LncRNA FEZF1-AS1通过miR-363-3p上调Sphk2表达。提示LncRNA FEZF1-AS1/miR-363-3p/Sphk2轴在Hela细胞增殖、侵袭和EMT过程中发挥重要作用。

综上所述,本研究提供了FEZF1-AS1表达与宫颈癌发展之间的联系。我们证实上调FEZF1-AS1通过miR-363-3p/Sphk2轴促进Hela细胞增殖、侵袭及EMT,表明FEZF1-AS1可能是一个候选的预后生物标志物和新治疗宫颈癌的靶点。