丙泊酚对脂多糖诱导肝癌细胞炎症反应、增殖、黏附、侵袭的影响及机制

齐少霞，杨栋宝，周 翼，武 倩，王晓东

(沧州中西医结合医院麻醉二科,河北 沧州 061000)

肝癌具有高发病率和高病死率等特点,大多患者确诊时已到晚期,经化学治疗和免疫治疗后仍有复发和转移,导致预后不良,因此,亟需寻求新的治疗措施[1]。肝炎与肝癌密切相关,急慢性肝炎会促进肝组织纤维化或肝硬化,进而导致肝癌发生[2]。因此,从炎症入手研究抗肝癌药物具有重要意义。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可诱导炎症反应,促进白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等促炎因子释放[3-4]。丙泊酚是一种典型的麻醉剂,其可通过调节细胞增殖、凋亡而在癌症中发挥抗癌作用[5],但其抗癌作用机制尚不完全明确。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是一种上皮到间质细胞的转化,可赋予细胞迁移和侵袭特性。研究报道,EMT与肿瘤的发生、侵袭、转移密切相关,还与肝癌患者的预后有关;EMT还可促进癌细胞产生促炎因子[6-8]。基于此,本研究旨在探讨丙泊酚对LPS诱导的人肝癌MHCC97H细胞增殖、凋亡、黏附、侵袭和EMT的影响及机制,以期为丙泊酚在肝癌治疗中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器

人肝癌MHCC97H细胞购自上海赛百慷生物技术股份有限公司;丙泊酚、LPS购自上海源叶生物科技有限公司,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)购自美国Gibco公司,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒购自杭州主诺生物技术有限公司,细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)购自上海翌圣生物科技有限公司, 5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU)细胞增殖检测试剂盒、人重组纤维连接蛋白(human recombinant fibronectin,rFN)购自上海碧云天生物技术有限公司,Hoechst 33258染色试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司,结晶紫水溶液、基质胶购自北京索莱宝科技有限公司,放射免疫沉淀分析(radio immuno precipitation assay,RIPA)裂解液购自美国Abw公司,细胞周期素D1(Cyclin D1)、caspase-3、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纤连蛋白(fibronectin,FN)、β-actin鼠抗人一抗和辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG二抗购自美国CST公司;311型CO2培养箱购自美国赛默飞公司,Multiskan SkyHigh型全波长酶标仪购自美国Thermo公司,DYCZ-24KF型四板垂直蛋白电泳仪购自北京六一生物科技有限公司,H4-20kr型低温高速离心机购自湖南可成仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 人肝癌MHCC97H细胞培养

将人肝癌MHCC97H细胞接种于含体积分数10%胎牛血清、体积分数1%青-链霉素的DMEM中,置于37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱中培养,待细胞贴壁达80%以上时进行细胞传代,取第4代对数期生长期MHCC97H细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞分组及处理

取对数生长期肝癌MHCC97H细胞,调整细胞密度至2×108L-1,接种至96孔板中,每孔100 μL;将肝癌MHCC97H细胞随机分为对照组、LPS组、低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组,对照组细胞不做干预,LPS组细胞滴加1 mg·L-1LPS干预48 h构建体外炎症模型,低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组细胞滴加1 mg·L-1LPS干预48 h后,分别加入12.5、25.0、50.0 μmol·L-1丙泊酚干预24 h,每组设置3个复孔,然后置于37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱中培养。

1.2.3 ELISA法检测MHCC97H细胞培养液中IL-1β和TNF-α表达水平

采用ELISA法测定细胞上清液中IL-1β和TNF-α表达水平,具体措施:收集药物干预24 h后各组细胞培养液,4 000 r·min-1离心20 min并收集上清液;分别将100 μL标准品及待测上清液加入酶标板中,37 ℃孵育2 h,弃去上清液,然后加 100 μL 生物素化抗体工作液和酶结合物工作液,37 ℃ 孵育1 h;洗涤后加入90 μL底物溶液,37 ℃孵育 10 min,再加入50 μL终止液;于5 min内测量各孔在450 nm处吸光度(absorbance,A)值,根据标准曲线计算IL-1β和TNF-α表达水平。

1.2.4 CCK-8法检测MHCC97H细胞活力

取药物干预24 h后各组细胞,加入CCK-8溶液10 μL,继续孵育2 h,使用酶标仪测定各孔在 450 nm 处A值,并计算细胞活力,细胞活力(%)=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。实验设置3个复孔,取均值。

1.2.5 EdU法检测MHCC97H细胞的增殖率

将MHCC97H细胞传代并铺于12孔板中,分组和药物处理同“1.2.2”项。取药物干预24 h后各组细胞,进行EdU处理,去除培养液,加入40 g·L-1多聚甲醛0.5 mL,固定细胞15 min,0.5 mL 体积分数3%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)洗涤3次;用0.5 mL体积分数0.3% TritonX-100室温固定10 min去除BSA,再用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗涤3次;12孔板中每孔加200 μL Click反应液,室温避光孵育30 min,PBS洗涤3次去除Click反应液;加入Hoechst 33342染液避光孵育10 min;PBS洗涤3次后装片,荧光显微镜拍照,应用Image J软件处理图片,以EdU阳性染色细胞(红色)占总细胞(蓝色)的百分比表示细胞增殖率。实验设置3个复孔,取均值。

1.2.6 Hoechst 33258染色法检测MHCC97H细胞凋亡率

取药物干预24 h后各组细胞,PBS洗涤细胞2次(每次5 min),加入新鲜配制的40 g·L-1多聚甲醛, 4 ℃固定10 min;洗涤3次,Hoechst 33258染色液(5 mg·L-1)染色10 min,洗涤3次,封固后荧光显微镜观察,应用Image J图像分析软件计算凋亡细胞数,细胞凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。实验设置3个复孔,取均值。

1.2.7 细胞黏附实验检测MHCC97H细胞的黏附细胞数

以无血清培养液稀释rFN,取10 μg·L-1的rFN胶铺96孔板,于超净工作台中过夜风干,风干后用PBS洗涤3次,每次20 min,备用。取药物干预24 h后各组细胞,用胰蛋白酶消化细胞,并制成单细胞悬液。取100 μL单细胞悬液(约1×104个细胞)加入到铺胶的96孔板中,设3个复孔,放置在37 ℃培养箱培养1 h,取出96孔板,吸取培养液,PBS洗涤3次,甲醇固定10 min,结晶紫染色 15 min,再用PBS洗涤3次,在50倍显微镜下观察并计算黏附细胞数。

1.2.8 Transwell小室法检测MHCC97H细胞的侵袭能力

将MHCC97H细胞传代并铺于24孔板中,分组和药物处理同“1.2.2”项。取-20 ℃保存的基质胶4 ℃过夜融化,用无FBS培养基稀释基质胶浓度至1 g·L-1,每个Transwell小室加入100 μL基质胶稀释液,置于37 ℃、含体积分数5% CO2培养箱培养5 h,使其呈干胶状。将Transwell小室放入24孔板中,在Transwell小室的上室中每孔加300 μL无血清的各组细胞悬液(1×108L-1),下室加入 600 μL 含有体积分数10% FBS的培养基,继续培养24 h后,取出Transwell小室,弃上清,棉签擦去小室薄膜上层细胞,PBS清洗后,40 g·L-1多聚甲醇固定 30 min。晾干后,用结晶紫染色10 min,PBS清洗3次。在显微镜下观察拍照,每孔随机选5个不同区域,应用Image J图像分析软件计算侵袭细胞数。

1.2.9 Western blot法检测MHCC97H细胞中Cyclin D1、caspase-3及EMT相关蛋白表达水平

取药物干预24 h后各组细胞,加入RIPA在冰上裂解,4 ℃ 12 000 r·min-1离心20 min,取上清进行蛋白变性后,制胶,行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶电泳,300 mA恒流转聚偏二氟乙烯膜,脱脂牛奶封闭2 h,然后加入E-cadherin(1:5 000)、N-cadherin(1:5 000)、Vimentin(1:20 000)、FN(1:6 000)、Cyclin D1(1:10 000)、caspase-3(1:2 000)及β-actin(1:5 000)一抗,4 ℃ 孵育过夜,用含吐温-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液(Tris buffered saline with tween 20,TBST)洗涤3次后加入辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG二抗,孵育2 h,弃去液体,TBST洗涤3次,最后加显影液,使用凝胶成像系统拍照,使用Image J软件计算灰度值,以β-actin为内参,计算蛋白相对表达量,以目的蛋白灰度值与内参蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。实验重复3次,取均值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 5组MHCC97H细胞培养液中IL-1β和TNF-α水平比较

5组MHCC97H细胞培养液中IL-1β和TNF-α水平比较差异有统计学意义(F=21.282、165.223,P<0.001);LPS组和低剂量丙泊酚组MHCC97H细胞培养液中IL-1β和TNF-α水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞培养液中IL-1β水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞培养液中TNF-α水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量丙泊酚组与LPS组MHCC97H细胞培养液中IL-1β和TNF-α水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞培养液中IL-1β和TNF-α表达水平显著低于LPS组和低剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞培养液中TNF-α水平显著低于中剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量丙泊酚组与中剂量丙泊酚组MHCC97H细胞培养液中IL-1β水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

表1 5组MHCC97H细胞培养液中IL-1β和TNF-α水平比较Tab.1 Comparison of IL-1β and TNF-α levels in MHCC97H cell culture medium among the five groups

2.2 5组MHCC97H细胞活力比较

对照组、LPS组、低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞活力分别为(100.00±6.44)%、(113.73±3.43)%、(100.94±5.48)%、(83.70±4.57)%和(72.04±3.64)%,5组MHCC97H细胞活力比较差异有统计学意义(F=33.939,P<0.001)。LPS组MHCC97H细胞活力显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组 MHCC97H 细胞活力显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量丙泊酚组与对照组MHCC97H细胞活力比较差异无统计学意义(P>0.05);低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞活力显著低于LPS组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H 细胞活力显著低于低剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量丙泊酚组与中剂量丙泊酚组MHCC97H细胞活力比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 5组MHCC97H细胞的增殖率比较

对照组、LPS组、低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组细胞增殖率分别为(45.84±4.07)%、(58.25±4.61)%、(44.81±7.10)%、(34.41±3.62)%、(26.53±1.94)%,5组细胞增殖率比较差异有统计学意义(F=20.820,P<0.001)。LPS组MHCC97H细胞增殖率显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞增殖率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量丙泊酚组与对照组MHCC97H细胞增殖率比较差异无统计学意义(P>0.05);低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞增殖率显著低于LPS组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞增殖率显著低于低剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量丙泊酚组与中剂量丙泊酚组MHCC97H 细胞增殖率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图1。

A:对照组;B:LPS组;C:低剂量丙泊酚组;D:中剂量丙泊酚组;E:高剂量丙泊酚组。图1 5组MHCC97H细胞增殖情况(×20)Fig.1 Proliferation of MHCC97H cells in the five groups(×20)

2.4 5组MHCC97H细胞的凋亡情况比较

对照组、LPS组、低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组细胞凋亡率分别为(8.08±0.55)%、(2.30±0.56)%、(7.64±0.77)%、(21.96±2.44)%和(32.93±3.38)%,5组细胞凋亡率比较差异有统计学意义(F=127.789,P<0.001)。LPS组MHCC97H细胞凋亡率显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞凋亡率显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量丙泊酚组与对照组MHCC97H细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05);低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞凋亡率显著高于LPS组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞凋亡率显著高于低剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞凋亡率显著高于中剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 5组MHCC97H 细胞的黏附细胞数比较

对照组、LPS组、低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组黏附细胞数分别为(124.33±10.50)、(157.33±11.50)、(111.00±4.58)、(85.33±4.16)和(52.00±4.36)个, 5组黏附细胞数比较差异有统计学意义(F=79.242,P<0.001)。LPS组黏附细胞数显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组、高剂量丙泊酚组黏附细胞数显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量丙泊酚组和对照组黏附细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05);低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组黏附细胞数显著低于LPS组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组黏附细胞数显著低于低剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量丙泊酚组黏附细胞数显著低于中剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见图2。

A:对照组;B:LPS组;C:低剂量丙泊酚组;D:中剂量丙泊酚组;E:高剂量丙泊酚组。图2 5组MHCC97H细胞黏附情况(×5)Fig.2 Adhesion of MHCC97H cells in the five groups(×5)

2.6 5组MHCC97H细胞的侵袭细胞数比较

对照组、LPS组、低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组侵袭细胞数分别为50.33±4.16、64.33±4.93、40.33±3.06、30.33±3.06和11.67±2.08,5组侵袭细胞数比较差异有统计学意义(F=92.402,P<0.001)。低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组侵袭细胞数显著低于对照组和LPS组,差异有统计学意义(P<0.05);LPS组侵袭细胞数显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组侵袭细胞数显著低于低剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量丙泊酚组侵袭细胞数显著低于中剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05)。 结果见图3。

2.7 5组MHCC97H细胞中Cyclin D1及caspase-3水平比较

5组MHCC97H细胞中Cyclin D1和caspase-3水平比较差异有统计学意义(F=147.325、38.414,P<0.001)。LPS组和低剂量丙泊酚组MHCC97H细胞中Cyclin D1水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组中MHCC97H细胞Cyclin D1水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞中Cyclin D1水平显著低于LPS组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞中Cyclin D1水平显著低于低剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量丙泊酚组与对照组MHCC97H细胞中caspase-3水平比较差异无统计学意义(P>0.05);LPS组MHCC97H细胞中caspase-3水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞中caspase-3水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞中caspase-3水平显著高于LPS组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞中caspase-3水平显著高于低剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组与高剂量丙泊酚组MHCC97H 细胞中Cyclin D1和caspase-3水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图4和表2。

表2 5组MHCC97H细胞中Cyclin D1及caspase-3水平比较Tab.2 Comparison of Cyclin D1 and caspase-3 levels in MHCC97H cells among the five groups

2.8 5组MHCC97H细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和FN水平比较

5组MHCC97H细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和FN水平比较差异有统计学意义(F=124.346、40.540、30.076、64.220,P<0.001)。LPS组和低剂量丙泊酚组MHCC97H细胞中E-cadherin水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H 细胞中E-cadherin水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞中E-cadherin水平显著高于LPS组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞中E-cadherin水平显著高于低剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05)。低剂量丙泊酚组N-cadherin水平和中剂量丙泊酚组FN蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);LPS组MHCC97H细胞中N-cadherin、Vimentin、FN水平及低剂量丙泊酚组中FN水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞中N-cadherin水平显著低于对照组,低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组 MHCC97H细胞中Vimentin水平显著低于对照组,高剂量丙泊酚组FN水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量丙泊酚组、中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H 细胞中N-cadherin、Vimentin和FN水平显著低于LPS组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞中N-cadherin、Vimentin和FN水平显著低于低剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞中Vimentin水平比较差异无统计学意义(P>0.05);高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞中E-cadherin水平显著高于中剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05);高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞中N-cadherin和FN水平显著低于中剂量丙泊酚组,差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表3和图5。

1:对照组;2:LPS组;3:低剂量丙泊酚组;4:中剂量丙泊酚组;5:高剂量丙泊酚组。图5 5组MHCC97H细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、FN蛋白表达(Western blot)Fig.5 Expressions of E-cadherin,N-cadherin,Vimentin and FN proteins in MHCC97H cells in the five groups(Western blot)

表3 5组MHCC97H细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和FN蛋白水平比较Tab.3 Comparison of E-cadherin,N-cadherin,Vimentin and FN protein levels in MHCC97H cells among the five groups

3 讨论

肝癌是一种常见的恶性肿瘤,具有较高的复发率和转移率,预后不佳[9]。肝癌与肝炎密切相关,长期炎症可引起肝硬化和肝癌,肝癌患者大都伴有全身系统性炎症,炎症反应在肝癌发生和转移过程中有促进作用,涉及许多生物学功能,如黏附、侵袭及EMT[10]。因此,寻找新的治疗手段改善癌细胞炎症对改善肝癌患者的预后具有重要意义。丙泊酚是外科手术中广泛使用的静脉麻醉剂之一,研究发现,其可参与许多癌症的病理生理过程,包括在各种癌症中的抗肿瘤作用和轻微的促癌作用[11]。已有研究报道,丙泊酚具有一定的抗肝癌作用[12],但其在与炎症相关的肝癌中的抗癌作用及机制尚不明确。因此,本研究以肝癌MHCC97H细胞为研究对象,采用细胞体外培养的方法观察丙泊酚对MHCC97H细胞活力、增殖、凋亡、黏附、侵袭及炎症因子IL-1β和TNF-α水平的影响。

本研究结果显示,LPS组MHCC97H细胞中IL-1β、TNF-α水平、细胞活力、细胞增殖率、黏附细胞数、侵袭细胞数高于对照组,细胞凋亡率低于对照组,中、高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞IL-1β、TNF-α水平、细胞活力、细胞增殖率、黏附细胞数、侵袭细胞数低于LPS组和低剂量丙泊酚组,细胞凋亡率高于LPS组和低剂量丙泊酚组,高剂量丙泊酚组MHCC97H 细胞中TNF-α表达水平、黏附细胞数、侵袭细胞数低于中剂量丙泊酚组,细胞凋亡率高于中剂量丙泊酚组,高剂量丙泊酚组与中剂量丙泊酚组MHCC97H细胞活力、细胞增殖率和IL-1β表达水平比较差异无统计学意义;说明,LPS诱导肝癌炎症模型构建成功,中、高剂量丙泊酚对LPS诱导的肝癌MHCC97H细胞炎症因子IL-1β和TNF-α水平、细胞活力、增殖、黏附、侵袭有显著抑制作用,对细胞凋亡有促进作用,且呈一定浓度依赖性;提示丙泊酚在肝癌的治疗中有良好的医学应用前景。

Cyclin D1是细胞增殖过程中的标志蛋白,以细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase 4,CDK)4和CDK6变构调节剂的作用调节从G1期到S期的转变,其高表达可促进细胞增殖[13]。细胞凋亡是一种多种因素诱导程序性细胞死亡的生物学过程,caspase-3是执行细胞凋亡的关键因子,活化后切割多种底物,调节有丝分裂后神经元和神经前体细胞中的程序性细胞死亡,在细胞凋亡中起重要作用[14]。本研究结果显示,LPS组Cyclin D1蛋白表达水平显著高于对照组,caspase-3蛋白表达水平显著低于对照组;中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组Cyclin D1蛋白表达水平显著低于LPS组和低剂量丙泊酚组,caspase-3蛋白表达水平显著高于LPS组和低剂量丙泊酚组;中剂量丙泊酚组与高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞Cyclin D1和caspase-3蛋白表达水平比较差异无统计学意义;说明,中、高剂量丙泊酚对LPS诱导的MHCC97H细胞中增殖蛋白Cyclin D1具有抑制作用,对凋亡蛋白caspase-3具有促进作用,且呈一定剂量依赖性;提示丙泊酚可能通过抑制Cyclin D1蛋白表达、促进caspase-3蛋白表达而发挥抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的生物学作用。

EMT是从上皮细胞到间充质细胞转化的一个过程,是癌症转移机制中研究的一个重点,EMT变化包括上皮细胞失去顶端-基底极性,获得较高的运动性,形成侵袭-转移[15],EMT与肝癌的发生发展密切相关[16]。有研究报道,丙泊酚可抑制缺氧诱导的食管癌细胞迁移、侵袭和EMT[17],抑制宫颈癌细胞的生长和侵袭[18],且其可以通过下调miR-21的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖和EMT[19],但关于丙泊酚在LPS诱导肝癌中调控EMT的作用机制尚未可知。本研究结果显示,LPS组N-cadherin、Vimentin和FN蛋白表达水平高于对照组,E-cadherin蛋白表达水平低于对照组;中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组N-cadherin、Vimentin和FN蛋白表达水平低于LPS组和低剂量丙泊酚组,E-cadherin蛋白表达水平高于LPS组和低剂量丙泊酚组;高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞E-cadherin蛋白表达水平显著高于中剂量丙泊酚组,而N-cadherin和FN蛋白表达水平显著低于中剂量丙泊酚组,中剂量丙泊酚组和高剂量丙泊酚组MHCC97H细胞Vimentin蛋白表达水平比较差异无统计学意义;说明,LPS可降低 MHCC97H 细胞上皮标志物 E-cadherin 表达水平,促进间充质标志物N-cadherin、Vimentin和FN的表达水平,而丙泊酚促进了E-cadherin蛋白表达,抑制了N-cadherin、Vimentin和FN蛋白表达,且呈一定剂量依赖性;这提示,丙泊酚可显著抑制LPS诱导的MHCC97H 细胞EMT进程。有研究表明,双氢青蒿素可抑制肝癌细胞生长,促进其凋亡,降低其迁移及侵袭能力,其机制可能为双氢青蒿素抑制肝癌细胞EMT进程[20];另有研究报道,阿帕替尼可抑制SMMC-7721细胞由上皮表型向间质表型转化,进而抑制肝癌细胞的侵袭和转移能力[21],炎症微环境下介导EMT能促进肝癌细胞侵袭转移[22];以上研究结果与本研究结果相似,证实丙泊酚可通过抑制EMT的进程来抑制LPS诱导的MHCC97H细胞增殖、黏附、侵袭及炎症,促进其凋亡。

4 结论

丙泊酚可抑制LPS诱导的人肝癌MHCC97H细胞增殖、黏附、侵袭及炎症,促进凋亡,其作用机制可能与抑制EMT进程有关,提示丙泊酚对肝癌的治疗有一定积极效果。但是本研究仅在体外实验证明了丙泊酚可抑制LPS诱导的人肝癌MHCC97H细胞的恶性行为,下一步将在动物模型探讨丙泊酚的作用,为丙泊酚在临床肝癌治疗中的应用提供更为全面的理论依据。