胃腺体组织癌变过程中CD44和survivin表达与幽门螺杆菌感染的相关性及其在胃癌浸润和转移中的作用

蔡迎彬，张玉俊，王 岩，李 可

(1.新疆医科大学附属肿瘤医院内镜诊疗中心,新疆 乌鲁木齐 830054;2.新疆医科大学公共卫生学院,新疆 乌鲁木齐 830011;3.新疆医科大学第五附属医院消化内科,新疆 乌鲁木齐 830000)

胃癌(gastric cancer,GC)是全球第五大常见癌症,也是癌症相关死亡的第三大原因[1]。肠型GC的发生有一个多阶段的癌前病变过程,包括慢性非萎缩性胃炎(chronic non-atrophic gastritis,CNAG)、慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)、肠上皮化生(intestinal metaplasia,IM)和异型增生(atypical hyperplasia,AH)[2]。研究表明,幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,HP)持续性和慢性感染在胃黏膜病变的恶性进展中发挥重要作用,被世界卫生组织(World Health Organization,WHO)确认为GC发展的Ⅰ类危险因素[3-4]。细胞毒素相关基因A蛋白是HP的主要毒力因子,可通过IV型分泌系统转入到宿主细胞中诱导基因组不稳定性[5],对基因表达水平产生影响,包括异常的DNA甲基化和RNA表达紊乱[6]。目前,HP感染与GC之间的相关性已得到广泛证实,但其确切分子机制仍有待进一步阐明。CD44是透明质酸的跨膜糖蛋白表面受体,参与细胞对其微环境的反应,并通过“外来素信号传导”在细胞-基质相互作用与细胞通信中发挥作用[7];且CD44在致癌、分化和淋巴结转移中起重要作用,可预测乳腺癌[8]、结直肠癌[9]和胃癌[10]等多种癌症的预后。研究表明,胃组织干细胞和胃癌干细胞均表达CD44剪接变体CD44v9,而关于CD44及其剪接变体因HP急慢性感染而发生表达改变的研究较少[11]。Survivin是细胞凋亡蛋白抑制剂(inhibitors of apoptosis,IAP)家族成员,在细胞周期的G2/M期高度表达,并在G1期迅速下降。Survivin是一种抗凋亡蛋白,可调节细胞存活,降低细胞损失率,促进细胞增殖,并为快速增长的肿瘤提供条件,从而为肿瘤转化提供优势,其与多数肿瘤的预后不良和生存率降低相关[12]。虽然有大量证据表明CD44和survivin在胃癌的发生发展中发挥重要作用,但其与并发HP感染的相关性尚不清楚。因此,本研究通过检测胃腺体组织癌变过程中CD44和survivin的蛋白、基因表达水平并分析其与HP感染的相关性,探讨HP感染致胃腺体组织癌变的可能机制,并分析CD44和survivin与临床病理特征间的相关性,以期为帮助临床GC的早期预防、精确诊断及靶向治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 标本来源

收集2022年4月至2022年6月于新疆医科大学附属肿瘤医院就诊的资料完整且为首次经胃镜及病理学检查后确诊为CNAG、CAG、IM、AH和GC的患者胃黏膜病变组织标本各50份,分别设为CHAG组、CAG组、IM组、AH组和GC组。其中男138例(55.20%),女112例(44.80%);汉族186例(74.40%),维吾尔族26例(10.40%),其他民族38例(15.20%);年龄32～70(53.01±8.46)岁。病例纳入标准:(1)符合文献[13]关于CNAG、CAG、IM、AH和GC诊断标准,并经胃镜及病理学检查确诊;(2)入组前未接受相关治疗;(3)年龄>18岁;(4)患者知情同意。排除标准:(1)在胃镜检查前1个月内有服用抗生素、抗酸剂和益生菌史;(2)有胃部手术史;(3)使用免疫抑制剂者;(4)有严重并发症患者;(5)有严重认知障碍或精神疾病者;(6)怀孕或哺乳期;(7)患血液系统疾病者,包括贫血和出血倾向。本研究方案严格按照赫尔辛基伦理标准进行,获得新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会审核批准,所有受试者和(或)家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 组织取材

患者空腹行胃镜检查,取距离幽门2～5 cm处胃窦大、小弯黏膜,胃窦处为肿瘤组织的取2 cm范围内癌旁黏膜及癌组织标本,保存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.2 快速尿素酶和碳14法检测HP

取-80 ℃冰箱保存的黏膜组织,放置在圆形黄色试纸上,并将该试纸与衬纸复合,保证衬纸、试纸之间含有组织,检测试纸购自上海惠泰医疗科技有限公司,严格按说明书进行操作。强阳性结果为试纸活检组织边缘在1 min时间内从黄色转变为樱红色;如延迟5 min变为樱红色为弱阳性,不变色为阴性。

另嘱患者在检查前8 h禁食、禁水和禁烟,检查时先让患者口服一粒碳14尿素胶囊,静坐15 min后向集气卡(安徽养和医疗器械设备有限公司)内呼气,当集气卡中央部分的蓝色转变为无色呼气停止,然后医护人员及时将集气卡收回标记、存放,将卡片放置在碳14呼吸测定仪(安徽养和医疗器械设备有限公司)中进行检测;结果>100 dpm·mmol-1为阳性,判定为HP感染。

1.2.3 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察黏膜组织形态

取-80 ℃冰箱保存的黏膜组织,将组织在100 g·L-1多聚甲醛中过夜固定,石蜡包埋,然后切成4～5 μm厚的组织切片;将组织切片在二甲苯中脱蜡并在乙醇中再水化,随后使用标准技术用苏木精和伊红染料染色,在OLYMPUS/BX40光学显微镜下观察组织形态。组织病理学分级根据WHO的标准分为:Ⅰ级(高分化),Ⅱ级(中分化),Ⅲ级(低分化)[14]。根据美国癌症分期联合委员会第7版(TNM分期)[15]记录病理分期。

1.2.4 免疫组织化学法检测胃黏膜病变组织中CD44和survivin的蛋白表达

取组织切片,用二甲苯脱蜡,然后用乙醇水合;使用柠檬酸(pH 6.0)抗原修复溶液(中国武汉Servicebio公司)在压力锅中进行抗原修复,然后用体积分数为3%的H2O2阻断内源性过氧化物酶活性30 min,体积分数10%正常山羊血清阻断非特异性抗原表位30 min;滴加CD44(滴度1:100,福州迈新生物技术公司)、survivin(滴度1:100,福州迈新生物技术公司)一抗,4 ℃下孵育过夜;用磷酸盐缓冲液洗涤后,滴加辣根过氧化物酶偶联山羊抗小鼠IgG二抗(滴度1:200),室温下孵育20 min;然后用二氨基联苯胺显色,苏木精复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明后封片;应用OLYMPUS/BX40显微镜拍照分析。使用半定量评分系统评估每张载玻片的CD44和survivin免疫染色强度及阳性上皮细胞百分比,由2名检查员独立评分。染色强度:无染色为0分,轻度为 1分,中度为 2分,重度为3分。阳性范围:<10%为0分,10%～45%为1分,46%～70%为2分,>75%为3分。将染色强度和阳性范围相加得到总分,即0分为阴性(-),1～2分为弱阳性(+),3～4分为阳性(++),5～6分为强阳性(+++),以+、++、+++为阳性。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测胃黏膜病变组织中CD44和survivin mRNA表达水平

取-80 ℃冰箱储存的100 mg新鲜组织,滴加1 mL TRIzol试剂(中国上海Invitrogen公司),通过匀浆器进行组织研磨,待研磨完全后加入1 mL氯仿并剧烈颠倒,混合均匀后,室温环境下静置5 min;4 ℃下12 000 r·min-1离心15 min后取上清液,加入500 μL异丙醇溶液静置10 min,然后4 ℃下12 000 r·min-1离心10 min除去上清液,用体积分数75%的乙醇溶液清洗沉淀。沉淀干燥后加入50 μL焦碳酸二乙酯处理过的双重去离子水溶解RNA,采用反转录试剂盒(福州迈新生物技术公司)将RNA反转录为cDNA。 采用实时荧光定量PCR检测CD44、survivin基因表达。CD44基因上游引物序列为5′-ATTTGAATATAACCTGCCGCTTTG-3′,下游引物序列为5′-TTGTGGGCAAGGTGCTATTG-3′;survivin基因上游引物序列为5′- CCGGATCCACCCATGGGTGCCCCGACGTTGC-3′,下游引物序列为5′-ACGCGTC-GACTCAATCCATGGCAGCCAGCT-3′;以甘油醛3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为内参,GAPDH基因上游引物序列为5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物序列为5′-GGCTGTTGTCATACTTCTC-3′。反应体系:cDNA(8×稀释)4.0 μL,上下游引物各0.4 μL,SYBR Green Master Mix 10.0 μL,50×ROX Reference Dye 20.4 μL。反应条件:50 ℃预变性2 min,95 ℃变性10 min,95 ℃退火30 s,60 ℃延伸30 s,共40个循环;采用2-ΔΔCt法计算靶基因相对表达量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 胃腺体组织癌变过程中HP感染率变化

250例患者中,快速尿素酶和碳14法联合检测HP感染率为50.4%(126/250); CNAG、CAG、IM、AH和GC患者HP感染率分别为10.0%(5/50)、24.0%(12/50)、44.0%(22/50)、68.0%(34/50)、80.0%(40/50), 呈显著增高趋势(χ2=68.068,P<0.001)。

2.2 5组患者胃黏膜病变组织中CD44和survivin蛋白阳性表达比较

CNAG组、CAG组、IM组、AH组和GC组患者胃黏膜病变组织中均有CD44蛋白表达,呈棕黄色颗粒,主要表达在细胞膜(图1);CNAG组、CAG组、IM组、AH组和GC组患者胃黏膜病变组织中CD44蛋白阳性表达率分别为4.0%、16.0%、32.0%、62.0%、80.0%,呈逐渐升高趋势,差异有统计学意义(χ2=84.50,P<0.001)。Survivin蛋白可在CAG组、IM组、AH组和GC组患者胃黏膜病变组织中检测到阳性表达,CNAG组患者胃黏膜病变组织中未检测到;survivin主要表达在细胞质,呈棕黄色颗粒为阳性表达(图2);CAG组、IM组、AH组和GC组胃黏膜病变组织中survivin蛋白阳性表达率分别为18.0%、38.0%、58.0%、68.0%,呈逐渐升高趋势,差异有统计学意义(χ2=67.63,P<0.001)。

A:CNAG组;B:CAG组;C:IM组;D:AH组;E:GC组。图1 5组患者胃黏膜组织中CD44表达(免疫组织化学染色)Fig.1 Expression of CD44 in gastric mucosa of patients in the five groups (immunohistochemical staining)

A:CNAG组;B:CAG组;C:IM组;D:AH组;E:GC组。图2 5组患者胃黏膜组织中survivin表达(免疫组织化学染色)Fig.2 Expression of survivin in gastric mucosa of patients in the five groups (immunohistochemical staining)

2.3 5组患者胃黏膜病变组织中CD44和survivin mRNA相对表达量比较

CNAG组、CAG组、IM组、AH组和GC组患者胃黏膜组织中CD44 mRNA相对表达量分别为0.094±0.015、0.114±0.011、0.172±0.026、0.223±0.041、0.367±0.035。CAG组、IM组、AH组和GC组患者胃黏膜组织中CD44 mRNA相对表达量显著高于CNAG组,差异有统计学意义(t=-7.600、-18.375、-20.894、-50.695,P<0.001); IM组、AH组、GC组患者胃黏膜组织中CD44 mRNA相对表达量显著高于CAG组,差异有统计学意义(t=-14.527、56.018、58.586,P<0.001);AH组和GC组患者胃黏膜组织中CD44 mRNA相对表达量显著高于IM组,差异有统计学意义(t=-82.924、90.456,P<0.001);GC组患者胃黏膜组织中CD44 mRNA相对表达量显著高于AH组,差异有统计学意义(t=95.645,P<0.001)。CNAG组、CAG组、IM组、AH组和GC组患者胃黏膜组织中survivin mRNA相对表达量分别为0.000±0.000、0.067±0.006、0.346±0.061、0.552±0.081、1.645±0.357;IM组、AH组和GC组患者胃黏膜组织中survivin mRNA相对表达量显著高于CAG组,差异有统计学意义(t=-49.948、49.538、49.028,P<0.001);AH组和GC组患者胃黏膜组织中survivin mRNA相对表达量显著高于IM组,差异有统计学意义(t=-91.053、51.859,P<0.001);GC组患者胃黏膜组织中survivin mRNA相对表达量显著高于AH组,差异有统计学意义(t=-213.721,P<0.001)。

2.4 5组HP阳性与阴性患者胃黏膜组织中CD44和survivin蛋白阳性表达率比较

CAG组、IM组、AH组和GC组HP阳性患者胃黏膜组织中CD44和survivin蛋白阳性表达率显著高于阴性患者,差异有统计学意义(P<0.01)。CNAG组HP阳性患者与阴性患者胃黏膜组织中CD44和survivin蛋白阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表1。

表1 5组HP阳性与阴性患者胃黏膜组织中CD44和survivin蛋白阳性表达率比较 Tab.1 Comparison of CD44 and survivin protein positive expression rate in gastric mucosa between the HP positive patients and HP negative patients in the five groups

2.5 GC患者癌组织中CD44和survivin蛋白表达与临床病理特征的相关性

CD44和survivin蛋白表达与GC患者癌组织分化程度、淋巴结转移、远处转移有关(P<0.05), CD44和survivin蛋白表达与GC患者的浸润深度无相关性(P>0.05)。结果见表2。

表2 GC患者癌组织中CD44和survivin表达与临床病理特征的相关性Tab.2 Correlation between CD44 and survivin expression and clinical pathological characteristics in gastric cancer tissues of GC patients

3 讨论

肠型GC的发展涉及从慢性胃炎到萎缩性胃炎、肠化生和胃发育不良多个过程[16]。研究表明,萎缩性胃炎伴肠化生和异型增生可显著增加胃癌的发生风险,而遗传和环境因素对GC的发生发展起到至关重要的作用[17]。HP感染已被确认为GC的重要危险因素,该细菌能诱导慢性黏膜损伤从而引起慢性胃炎和胃溃疡等炎症性疾病,导致胃黏膜屏障功能受损,进一步诱导黏膜相关淋巴瘤及胃癌等恶性肿瘤的发生发展[18]。本研究结果显示,CNAG、CAG、IM、AH和GC患者中HP感染率分别为10.0%(5/50)、24.0%(12/50)、44.0%(22/50)、68.0%(34/50)、80.0%(40/50),HP感染率呈显著增高趋势;这进一步证实,HP感染参与了从慢性胃炎到萎缩性胃炎、肠化生、GC的发生、发展。然而,HP感染引起胃黏膜细胞恶变的确切机制迄今尚不完全清楚[19]。

CD44是细胞外基质的重要黏附分子,其表达与肿瘤细胞的侵袭迁移能力密切相关[20]。CD44作为透明质酸的细胞表面受体,可干扰多种生物过程,如细胞黏附、细胞迁移和癌症转移,其被认为是多种癌症的重要生物标志物,与预后不良相关[21]。此外,CD44基因的过表达可增加肺癌[22]、口腔癌[23]和胃癌[24]等癌症发病风险。DMMRICH等[25]研究报道,CD44在慢性萎缩性胃炎和伴有异型增生改变的肠化生胃癌前病变中过表达。并且,有研究报道,随胃腺体组织癌变恶性程度的增加CD44阳性细胞百分比也增加[26]。本研究结果显示, CNAG组、CAG组、IM组、AH组和GC组患者胃黏膜病变组织中CD44蛋白阳性表达率为4.0%、16.0%、32.0%、62.0%、80.0%,呈逐渐升高趋势;CAG组、IM组、AH组和GC组患者胃黏膜组织中CD44 mRNA相对表达量显著高于CNAG组,IM、AH、GC组患者胃黏膜组织中CD44 mRNA相对表达量显著高于CAG组,AH、GC组患者胃黏膜组织中CD44 mRNA相对表达量显著高于IM组,GC组患者胃黏膜组织中CD44 mRNA相对表达量显著高于AH组;且CAG、IM、AH和GC组HP阳性患者胃黏膜组织中CD44蛋白阳性表达率显著高于阴性患者;这说明,CD44蛋白和mRNA表达水平随着胃腺体组织癌变恶性程度的加重而升高,提示在胃腺体组织癌变过程中HP 感染可能诱导CD44表达,从而改变黏膜细胞的生物学活性,促进了从慢性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生到GC的发生、发展进程。

Survivin为凋亡抑制蛋白家族成员之一,可通过促进有丝分裂和抑制细胞凋亡来促进癌细胞的存活和生长[27],其表达水平与更具侵袭性的疾病和较差的临床结局相关。研究报道,survivin在多种人类恶性肿瘤中广泛表达,与肿瘤细胞增殖、生长、凋亡及肿瘤形成具有密切关系,可作为食管癌[28]、结直肠癌[29]和胃癌[30]的诊断标志物。另有研究报道,survivin的过表达与GC的发生和发展密切相关[31]。BURY等[32]研究报道,GC患者中的survivin表达率为73.17%;GU等[33]研究发现,survivin在GC组织中的表达率为62.9%。本研究结果显示,CAG组、IM组、AH组和GC组胃黏膜病变组织中survivin蛋白阳性表达率分别为18.0%、38.0%、58.0%、68.0%,呈逐渐升高趋势;IM组、AH组、GC组患者胃黏膜组织中survivin mRNA相对表达量显著高于CAG组,AH、GC组患者胃黏膜组织中survivin mRNA相对表达量显著高于IM组, GC组患者胃黏膜组织中survivin mRNA相对表达量显著高于AH组;且CAG、IM、AH和GC组HP阳性患者胃黏膜组织中survivin蛋白阳性表达率显著高于阴性患者;这说明,survivin蛋白和mRNA表达水平同样随着胃腺体组织癌变恶性程度的加重而升高,提示在胃腺体组织癌变过程中HP 感染可能同样诱导了survivin表达,从而改变黏膜细胞的生物学活性,促进了从慢性胃炎、萎缩性胃炎、肠化生到GC的发生、发展进程。

目前,survivin和CD44的表达与GC患者癌组织分化程度、浸润深度和淋巴结转移之间的关系尚不清楚。MIYACHI等[34]研究发现,survivin的表达与淋巴结转移有关,但与浸润深度无关;TSUBURAYA等[35]研究表明,survinin mRNA表达与浸润深度有关,但与淋巴结转移无关。HOU等[36]研究报道,CD44表达水平与浸润程度、分化程度和淋巴结转移有关;XIE等[37]研究发现,CD44阳性表达与浸润深度和淋巴结转移相关。本研究结果显示, CD44和survivin的蛋白表达与GC患者的癌组织分化程度、淋巴结转移、远处转移相关,即低分化程度、有淋巴结转移、有远处转移的患者癌组织中CD44和survivin蛋白阳性表达率更高,这与上述研究结果相似,提示CD44和survivin在一定程度上可促进GC的浸润和转移,对GC患者的预后和生存评估具有重大意义。

4 结论

HP感染与CD44和survivin基因表达间存在正关联,胃腺体组织癌变过程中HP 感染可能诱导CD44和 survivin 基因表达,从而通过改变黏膜细胞的生物学活性来发挥促癌作用,CD44和survivin在一定程度上可促进GC的浸润和转移,对GC患者的预后和生存评估具有重大意义,这为开发诊断和治疗GC新策略提供了理论基础。然而,本研究样本量小且为横断面研究,需进一步的随访研究来验证HP感染与CD44和survivin的关系及对GC发生发展的影响。