经气管镜超声引导针吸活检术联合核酸扩增试验对肺门/纵隔淋巴结结核的诊断价值

李媛媛，常炜，阿尔泰，高孟秋

1 首都医科大学附属北京胸科医院 北京市结核病胸部肿瘤研究所结核科，北京 101149；2 新疆医科大学第八附属医院呼吸与危重症医学科；3 新疆医科大学第八附属医院胸外科；4 新疆医科大学第八附属医院科教科

结核病是全球重大公共卫生问题之一，是法定报告传染病中发病率和病死率均较高的一种疾病类型［1］。纵隔淋巴结核过去常见于儿童的原发型肺结核，现阶段成人型纵隔淋巴结核亦逐渐增多［2］。在既往临床工作中，我们通过支气管镜检查发现越来越多的支气管淋巴瘘型气管结核，此类患者病情进展迅速，传染性较高［3］，若不及时治疗则会导致结核蔓延，引起严重的全身症状，故早期诊断肺门/纵隔淋巴结结核对于指导临床治疗有重要意义。目前临床多采用常规影像学检查，但其无法进行定性判断，缺乏组织病理学和细菌学依据，极易误诊［4］。超声支气管镜（EBUS）是一种在支气管镜前端装置超声探头的设备，另配备专用的吸引活检针，可在实时超声引导下行经支气管针吸活检（TBNA）［5］。EBUS具有电子凸阵扫描的彩色能量多普勒超声，有助于操作过程中确认血管位置，易于分辨淋巴结和血管的界限及解剖关系，防止误穿血管，提高TBNA的安全性。感染性疾病的组织病理学观察往往缺乏特异性，多数实验室还无法在病理中应用实时荧光定量PCR对结核分枝杆菌DNA进行检测。这需要高效的病原学检测方法来进一步补充组织病理诊断的不足以提高诊断效率。因此，本研究通过探究EBUSTBNA联合核酸扩增试验对肺门/纵隔淋巴结结核的诊断价值，以期为肺门/纵隔淋巴结结核的临床诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019年1月—2022年1月于新疆医科大学第八附属医院接受EBUS-TBNA的疑似纵隔淋巴结结核患者为研究对象。纳入标准：①临床诊断为肺结核，影像学证实为肺门/纵隔淋巴结肿大；疑似肺结核，影像学证实为肺门/纵隔淋巴结肿大；影像学证实单纯孤立肺门/纵隔淋巴结肿大；上述条件符合任一即可；②无支气管镜检查禁忌证；③无经气管镜超声引导针吸活检术禁忌证；④患者知情同意并签署知情同意书。排除标准：①伴有严重心、肝功能障碍者；②伴有凝血功能障碍者；③伴有哮喘发作或大咯血者；④全麻不耐受或对麻醉药物过敏者；⑤伴有精神疾病者。本研究共纳入159例疑似纵隔淋巴结结核患者，其中男73例、女86例，年龄20~50（30.25 ± 6.65）岁。本研究经新疆医科大学第八附属医院伦理委员会审核批准（2019伦审001）。

1.2 经EBUS-TBNA抽吸活检针负压抽吸标本采集 患者术前6 h禁食水，建立静脉通道，有创动脉血压监测。患者取仰卧位，经口插喉罩或单腔气管插管进行全麻，术中机械辅助通气。经喉罩进入超声内窥镜，开启彩色多普勒超声探查，确认穿刺目标，固定超声内窥镜，测量目标大小，预计穿刺深度。通过内镜进入穿刺针，固定穿刺针的穿刺深度，刺入目标后，超声可见穿刺目标内强回声影，确定穿刺针位于目标内，将活检针柄推出，然后启动切割开关。用上述方法再次穿刺活检，获得2~3条相对完整的组织条，用甲醛固定。如果病变较小或坏死面积较大，无法活检，则使用抽吸活检针负压抽吸标本，喷在载玻片上。

1.3 标本检测 ①细菌学检测：抽吸活检针负压抽吸标本置入无菌培养管中进行结核分枝杆菌培养；②核酸扩增试验检测：抽吸活检针负压抽吸标本置入无菌容器，进行实时荧光核酸恒温扩增试验，若试验结果阳性进一步行实时荧光PCR熔解曲线完成分子药物敏感性检测；③病理检测：所得组织标本10%中性液固定，之后分别经组织脱水、石蜡包埋、切片，经苏木素-伊红染色，光学显微镜下辨别活检标本的良恶性及细胞类型。肉芽肿性改变标本进行抗酸染色。

1.4 药物敏感性试验 分子DST检测：采用厦门致善生物科技股份有限公司生产的SLAN-96S型实时荧光定量PCR仪以及BY-R18型低温高速离心机。使用溶解曲线检测试剂盒，严格按照链霉素、利福平、异烟肼、乙胺丁醇、氟喹诺酮类耐药突变试剂盒说明书操作。当样本的熔解温度与阳性对照的溶解温度一致（误差不超过1 ℃）时判定为野生型；样本的Tm低于阳性对照2 ℃及以上时判定为突变型。

表型DST检测：采用美国BD公司生产的BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养监测系统及配套试剂，依据说明规范进行结核菌培养及DST检测。以生长单位（GU）指数评估耐药结果：含药品培养管的GU值<100为敏感，≥100为耐药。检测药物包括链霉素、利福平、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺。

1.5 诊断结果判定［6］结核培养结果判定：MGIT 960培养显示存在结核分枝杆菌即为阳性。实时荧光核酸恒温扩增检测结果判定：检测样本CT值等于40或0的样本为阴性样本，检测样本CT值≤37.0者判为阳性，CT值>37.0的样本建议重做，重做结果CT值<40者为阳性，否则为阴性。组织病理学分为5级：表皮样肉芽肿反应伴干酪坏死为Ⅰ级；无干酪坏死上皮样肉芽肿反应为Ⅱ级；非肉芽肿反应伴坏死为Ⅲ级；非特异性为Ⅳ级；样本不足为Ⅴ级。Ⅰ～Ⅲ级或抗酸染色阳性被认为是高度怀疑的结核病，判断为组织病理学阳性。耐药结核诊断判定［7］：单耐药（MR-TB）定义为感染的结核菌仅对1种一线抗结核药产生耐药；多耐药（PR-TB）定义为对1种以上一线抗结核药产生耐药，但不包括同时耐利福平和异烟肼；耐多药（MDR）指至少同时对异烟肼和利福平耐药；利福平耐药（RR-TB）指对利福平耐药的结核病。患者最终被分为三类：“病原学确诊”肺门/纵隔淋巴结结核：包括MGIT 960培养或NAAT阳性；“可能的”肺门/纵隔淋巴结结核（缺乏病原学阳性结果，但有典型的组织病理表现提示结核病，具有与结核一致的典型症状和体征，对抗结核治疗有良好反应）；“非结核”（诊断为非结核或者如果在没有抗结核治疗的情况下出现临床症状改善）。在本研究中，最终临床诊断作为肺门/纵隔淋巴结结核的参考标准，即综合诊断，包括基于所有可用数据联合组织病理学、病原学、免疫学检测和抗结核治疗反应的“明确”和“可能”病例。

1.6 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料符合正态分布以表示，比较采用t检验。计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床诊断结果 患者均顺利完成EBUS-TB‐NA，经过6个月随访，对所有研究对象进行最终诊断。在159例肺门/纵隔淋巴结肿大病例中，通过EBUS-TBNA诊断为结核112例，诊断为非结核33例（肺癌16例，淋巴结炎7例，结节病4例，尘肺4例，非结核分枝杆菌病1例，淋巴瘤1例），14例未得到任何阳性证据。14例中9例通过诊断性抗结核诊断为结核病，5例再次复查气管内镜及手术等一系列检查后诊断为非结核性疾病（肺癌2例，淋巴瘤2例，结节病1例）。最终临床诊断肺门/纵隔淋巴结结核患者121例，肺癌18例，淋巴结炎7例，结节病5例，尘肺4例，淋巴瘤3例，非结核分枝杆菌病1例。159例肺门/纵隔淋巴结肿大患者中合并肺结核95例。

2.2 EBUS-TBNA在纵隔淋巴结结核中的诊断结果 以综合诊断为标准，92.56%（112/121）的肺门/纵隔淋巴结结核患者经EBUS-TBNA穿刺物标本确诊。经过EBUS-TBNA诊断为肺门/纵隔淋巴结结核的112例中，98例组织病理结果阳性，46例为结核菌培养阳性，79例核酸检测阳性。

2.3 EBUS-TBNA不良反应发生率 患者均能耐受操作，1例术中出现低氧血症，2例术后咯血，经止血和吸氧后均得到明显改善；2例术后发热，服用复方对乙酰氨基酚片后体温恢复正常。不良反应发生率为3.14%（5/159）。

2.4 EBUS-TBNA不同检测方法对肺门/纵隔淋巴结结核诊断的灵敏度、特异度和准确率比较 如表1所示，核酸扩增试验对结核分枝杆菌检测的敏感度较高，高于结核菌培养，与组织病理学无统计学差异；特异度达到100%，高于组织病理学，与结核菌培养一致；准确度亦较高，高于结核菌培养，与组织病理学差异无统计学意义；结核菌培养敏感度最低，组织病理学的特异度最低。组织病理学存在8个假阳性：结节病4例，肺癌淋巴结转移3例，非结核分枝杆菌病 1例。

表1 EBUS-TBNA不同检测方法诊断结果比较

2.5 肺门/纵隔淋巴结结核的耐药情况

2.5.1 肺门/纵隔淋巴结结核的耐药特征 121例肺门/纵隔淋巴结结核患者中EBUS-TBNA标本MGIT 960培养阳性46例，有7例对检测药物中任一种或两种以上药物耐药，表型耐药检出总耐药率为15.22%。其中耐多药结核病（同时耐异烟肼、利福平）2例，多耐药结核病（同时耐异烟肼、乙胺丁醇）1例，利福平耐药结核病1例，异烟肼单耐药结核病3例。表型DST检出耐药顺位情况：耐异烟肼13.04%（6/46）、耐利福平6.52%（3/46）、耐乙胺丁醇2.17%（1/46），对异烟肼耐药率较高。EBUS-TBNA标本核酸扩增试验检测阳性79例，分子耐药检出耐药8例，比表型耐药多检出1例利福平耐药结核病，余耐药与表型耐药一致。

2.5.2 分子与表型DST利福平和异烟肼耐药性的检测结果比较 荧光PCR熔解曲线法的DST结果平均报告时间为（24.0 ± 9.6）h，BACTEC MGIT 960 DST结果平均报告时间为（34.0 ± 5.0）d。荧光PCR溶解曲线法的DST结果明显短于BACTEC MGIT 960法表型DST检测时间（t=9.375，P<0.05）。经EBUS-TBNA诊断肺门/纵隔淋巴结结核患者行表型DST检出耐利福平的有3例，耐异烟肼的有6例。以表型DST检测结果为参照标准，经EBUS-TBNA诊断肺门/纵隔淋巴结结核患者中，分子DST检出耐利福平的有4例，耐异烟肼的有6例，与表型DST结果一致性较高。

3 讨论

肺门/纵隔淋巴结结核属原发性肺结核的一种亚型，多发生于初次感染结核菌者，其发病率逐年上升［8］，肺门/纵隔淋巴结结核临床通常表现为不典型，易出现误诊、漏诊现象。传统有创检查方法中，纵隔镜和胸腔镜是推荐的诊断方法，但其风险高、取得组织标本的淋巴结区域有限［9］。因此临床需寻求准确且安全性高的评估手段以对肺门/纵隔淋巴结结核进行诊断。

本研究结果显示，EBUS-TBNA可有效鉴别肺门/纵隔淋巴结肿大患者。EBUS-TBNA是将内镜学和超声学相联合，具有操作方便、范围广、并发症少等优点，其可通过多勒普超声技术动态观察病灶内血供，分析其生长方式、质地及回声、是否外侵等生物学特点，明确周围血管分布情况指导选择合适的穿刺部位，安全完成操作过程［10］。EBUS-TBNA在EBUS图像中通过利用病变在淋巴组织内侵犯破坏、导致液化及随之出现的硬化、增殖等改变，利用多普勒超声系统对其回声特征分析准确判断病灶部位，随之利用穿刺针抽吸病变组织进行病理及病原学检测，可提高肺门/纵隔淋巴结结核的准确率。既往研究已证实EBUS-TBNA对肺门/纵隔内恶性疾病有较高的诊断价值，丁群力等［11］通过对124例肺门/纵隔淋巴结肿大患者进行EBUS-TBNA检测，可有效诊断出肺门/纵隔淋巴结结核患者，病原学诊断率为82.60%；MOHAN等［12］通过EBUS-TBNA检测临床可能为纵隔结核病的孤立性纵隔淋巴结肿大患者发现，EBUS-TBNA是一种有效、安全的胸腔内结核病诊断工具；此外，TETART等［13］研究指出，EBUS-TB‐NA对HIV感染患者胸部淋巴结病诊断的准确率达92%，可作为结核病低发病率地区HIV感染患者纵隔淋巴结病的一种安全、准确的检查方法。本研究与以上研究均显示EBUS-TBNA为诊断肺门/纵隔淋巴结结核的有效方法。本研究结果还显示，EBUSTBNA穿刺组织活检均顺利完成，不良反应发生率为3.14%，表明EBUS-TBNA穿刺组织活检安全性较高。EBUS-TBNA为超声监测下实时穿刺，因此引起大血管损伤出血的概率极小，另22G、21G的穿刺针较细也不易引起纵隔气肿、气胸等发生。GONU‐GUNTLA等［14］的一项回顾研究分析表明，在使用EBUS-TBNA中未出现严重纵隔气肿、气胸等并发症，仅出现穿刺部位少量出血，提示EBUS-TBNA具有较高的安全性。

从本研究结果来看，组织病理结果灵敏度较高，特异度较低，并且淋巴结穿刺操作能否穿到干酪坏死部位对结果影响较大，但细胞学可对恶性淋巴结肿大等其他疾病进行鉴别，故应作为细针淋巴结穿刺检查常规送检项目。穿刺标本仅靠组织病理结果判读时应注意将结核巨细胞作为特异性细胞学特征，若表现为上皮样肉芽肿，则需要联合临床进行充分鉴别诊断，包括结核或其他特殊感染如非结核分枝杆菌、真菌、放线菌、诺卡菌等、结节病、结缔组织病、药物相关肺损害以及淋巴瘤等［15］。传统的结核分枝杆菌检测方法，如抗酸杆菌涂片镜检，灵敏度低，不能区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。标本中每毫升必须存在5 000~10 000个细菌时，才能通过显微镜观察到结核病细菌。结核分枝杆菌培养是结核诊断的金标准，但其灵敏度较低，周期较长，不能满足结核病的早诊断早治疗的临床需求［16］。结核菌培养需活菌才能报告阳性，但淋巴结核中结核分枝杆菌数量少，如经过抗结核治疗，培养阳性的可能性较小，因而无法获得满意的阳性结果。随着诊断技术的进步和越来越多的临床研究评估，新的分子生物学方法诊断手段在临床实践中受到越来越多关注［17］。核酸扩增试验是一种快速的分子诊断技术，其使用的目标基因（DNA或RNA）为结核分枝杆菌所特有，而进行基因扩增、测序检测系列，是不依赖标本菌群质量及数量的。与传统培养相比，具有快速、敏感且能除外其他非结核分枝杆菌的干扰等优点；此外，在PCR基础上检测耐药基因，从而获得早期耐药信息［18］。本研究中采用的实时荧光核酸恒温扩增技术是一种结核病分子快速诊断技术，是一项基于结核分枝杆菌核酸提取、扩增为基础的全自动分子生物学检测技术，少量标本即可完成检查。其还采用实时荧光定量PCR技术自动进行检测，最大程度减少由于人工操作导致样品间出现交叉污染的可能性。

近年来，随着抗结核药物的广泛使用，结核分枝杆菌的耐药情况较严重，导致结核病近期疗效差，远期复发率高［19］。当前，结核耐药的诊断依据主要源于结核菌培养，其中BACTECMGIT960液体药敏试验是临床上检测结核分枝杆菌对常用抗结核药品耐药性的常用方法之一，但其通常需对患者痰液中菌群进行培养，结核分枝杆菌生长缓慢，检测周期较长，易致患者错过最佳治疗时期［20］。本研究中采用的分子药物敏感性试验使用荧光PCR熔解曲线检测，其原理是在PCR完成后，通过实时监测温度变化过程中探针荧光强度变化情况，得到荧光强度或者荧光强度相对温度的负导数随温度变化的曲线，即探针熔解曲线，从探针熔解曲线上可以获得探针与靶序列杂交的熔点值（Tm值）。当荧光探针与不同的靶序列杂交时，由于碱基匹配程度不同，形成双链DNA的稳定性也各不相同，其Tm值存在差异。一条荧光探针可同多条序列相近的靶序列杂交产生不同的Tm值，因此根据Tm值的差异就可以实现不同靶的检测和区分，即Tm值的多重检测，可实现链霉素、利福平、异烟肼、乙胺丁醇、氟喹诺酮类耐药的进一步检测，有利于对耐药患者进行快捷诊断并减少耐药患者的传播。本研究结果显示，46例结核菌培养阳性患者中，总耐药率15.22%，其中异烟肼耐药率较高，这与既往肺门/纵隔淋巴结结核化疗方案以异烟肼为主有关。耐药的产生主要与编码药物靶标的基因、染色体或药物激活酶总体突变，从而影响靶位酶与药物联合产生耐药性。异烟肼发挥对分枝杆菌的毒性作用需要过氧化物酶和过氧化氢酶或KatG的细胞激活，而当KatG突变时则会产生对结核分枝杆菌的耐药性，其中以KatG S315T突变为主［21］。本研究结果显示，分子DST检测利福平、异烟肼耐药性与表型DST结果一致率较高，但极大地缩短了报告时间，有助于早期明确结核患者耐药谱，因此对于已发现的耐药结核病患者，应联合药物敏感性试验结果及既往治疗史有针对性地早期制定耐药抗结核方案，最大限度避免临床不合理用药。

综上所述，EBUS-TBNA联合核酸扩增试验对肺门/纵隔淋巴结结核患者有一定诊断价值，且不良反应发生率较低，还可依据其结核分枝杆菌分子耐药信息，开展耐药结核病精准治疗，早期制定合理抗结核方案。这将成为痰检病原学检测阴性病例有意义的补充诊断方式。由于本研究中患者病例数较少，后续仍需扩大样本量进一步验证。