甲烷氧化菌素模拟酶催化显色法检测小麦粉中过氧化钙

徐阳，辛嘉英，2*，王雨晴，王贵儒，尹一

（1.哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076；2.中国科学院兰州化学物理研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃 兰州 730000）

过氧化钙（CaO2）是一种常见的无机化合物，为淡黄色粉末，难溶于水，易溶于乙醚等有机溶剂，是常见的化工原料，在食品开发、加工等领域应用广泛。在食品工业领域还可用作小麦粉增白剂、杀菌剂等[1-3]，天然小麦粉一般呈乳白色或黄色，且不易加工成面团[4]，而将过氧化钙添加到小麦粉中，既可以提高面筋韧性，还可以有效提高小麦粉的色泽，由于CaO2作为小麦粉添加剂会对人体健康构成潜在危险，如食用过量会刺激肠道、诱发癌症等[5]，自2011 年，我国卫生部门已经全面禁止在小麦粉中添加过氧化钙[6]，为了防止一些生产厂商以此获得利益，进一步保障食品安全，维护消费者权益，小麦粉中过氧化钙的检测受到越来越多的关注及重视。常用的过氧化钙检测方法有物理法、化学法等[7-8]，但这些方法在操作时通常会产生无法避免的误差，导致试验结果误差较大、准确度低。因此，酶法检测被广泛开发。其中，过氧化物酶（peroxidase，POD）及其模拟酶已经被广泛应用于食品和生物领域[9-10]，应用前景良好。

张玉荣等[11]提出酶法检测小麦粉中CaO2含量，利用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）为生物催化剂，HRP 是常见的天然过氧化物酶，CaO2与硫酸反应可生成H2O2，在碘化钾（KI）的存在下，HRP 可催化H2O2氧化季胺，使其快速生成一种黄色物质，从而对小麦粉中CaO2进行定量分析。此方法具有较高的精密度、准确度及高灵敏度，但HRP 是天然过氧化物酶，易受外界环境因素如温度、pH 值的影响。在一般的酶催化反应进程中，温度越高，反应速度越快，当温度过高时，天然酶会失活，降低反应温度，反应速度也会下降。在上述反应体系中，酸化后的溶液需将溶液pH 值调节至中性，在中性条件下，检测才能进行，这导致试验操作更加繁琐、效率降低，从而存在一定局限性[12]。因此，使用稳定性好、温度和pH 值范围广的模拟酶替代天然酶，成为实现酶法检测小麦粉中CaO2的关键。

甲烷氧化菌是一类以甲烷为能量来源及碳源的细菌，甲烷氧化菌素（methanobactin，Mb）是一种由甲烷氧化菌发酵分泌的菌素，具有抗氧化、抗菌作用[13-15]。它是一种小分子荧光肽，对铜有很强的亲和力[16]，Mb可以通过其来自2 个恶唑酮环的氮和来自2 个烯硫醇基团的硫来配位单个Cu（II）离子[17]，且与Cu 配位后具有良好的过氧化物酶活性，配位后的Mb-Cu 能在更宽的温度和pH 值范围内催化反应[18]。Xin 等[19]基于在Mb-Cu 的催化下，H2O2能快速氧化苯酚和4-氨基安替比林（4-aminoantipyrine，4-AAP）生成红色醌亚胺的原理，建立了一种新的催化体系检测小麦粉中CaO2。Mb 非常稳定，在酸性介质及50 ℃下也能保持良好的催化活性[20]。因此试验过程可省略调节pH 值这一步骤。此条件下，Mb 表现出较高的POD 活性，此检测方法速度更快、操作过程更简单，并且试验结果良好、准确度高，已成功应用于小麦粉中过氧化钙的测定。季胺是一类可测定多种物质的灵敏试剂，可作为底物被过氧化氢氧化从而显色，并且可很好地溶于微酸性水溶液[21-22]，由于过氧化钙在酸性介质中可生成H2O2，因此季胺作为底物可更好地应用于小麦粉中过氧化钙的检测。

基于Mb-Cu 的良好POD 活性，本文建立了Mb-Cu-KI-季胺新体系，利用Mb-Cu 催化过氧化氢氧化季胺显色的原理检测小麦粉中CaO2含量并优化反应条件，方法操作简单、速度快，可应用于小麦粉CaO2的检测，为小麦粉中过氧化钙的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦粉：市售；甲烷氧化菌：清华大学环境生物技术实验室提供；甲烷（99.99%）：哈尔滨黎明气体有限公司；甲醇、季胺（均为分析纯）：天津市福晨化学试剂有限公司；无水乙醇、磷酸二氢钠（均为分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；大孔树脂：美国Supelco 公司；五水合硫酸铜（分析纯）：汕头市西陇化工工厂有限公司；过氧化钙（75%）：上虞洁华化工有限公司；磷酸氢二钠（分析纯）：苏州力坤精细化工有限公司；碘化钾（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；浓硫酸（分析纯）：北京化学试剂公司；试验用水均为二级水。

1.2 仪器与设备

UV-2550 紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；FDU-1200 冷冻干燥机：东京理化器械公司；HL-2S 恒流泵：上海沪西分析仪器厂；HDL 组合式紫外检测器：上海金达公司；BLBI0-HYG-FJ2 生物反应器摇床：上海百仑生物科技有限公司；RV8V 旋转蒸发仪：德国IKA 公司；BCD-215GM 冰箱：合肥美的电冰箱有限公司；DF-101S 磁力搅拌器：上海越众仪器设备有限公司；HWS24 电热恒温水浴锅：上海一恒科技有限公司；800XL 颜色扫描器：上海中晶科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 甲烷氧化菌素的分离与纯化

参考文献[13]的方法，配制无机盐（nitrate mineral salt，NMS）培养基，以甲基弯菌（Methylosinus trichosporium）OB3b 为菌种，使用NMS 培养基对其进行121 ℃高温灭菌、换气，时间为5～6 d，将得到的发酵液离心30 min（8 000 r/min，4 ℃），离心后所得到的菌液上清液经已活化的大孔树脂吸附，在组合式紫外检测器的检测下，用60%甲醇溶液对树脂进行洗脱，获得Mb，通过34 ℃、130 r/min 旋转蒸发后，液体状Mb 再经过冷冻干燥后得到粉末状Mb，放入-30 ℃冰箱中备用。

1.3.2 Mb-Cu 的制备

将冻干后的Mb 配制成各个浓度的溶液置于比色皿中，放入紫外-可见分光光度计，使用微量进样器向比色皿中每隔30 s 加入5 μL 浓度为10 nmol/L 的CuSO4溶液，观察紫外光谱曲线，当曲线逐渐趋于一致时，减少CuSO4溶液的加入量，改为加入2 μL，直至曲线峰型不再变化，Mb-Cu 制备完成。

1.3.3 过氧化钙标准溶液的制备

准确称量1.55 g 过氧化钙，加入10 mL 体积分数为10%的稀硫酸，磁力搅拌4 min，转入100 mL 容量瓶，蒸馏水定容，再稀释100 倍，获得0.1 mg/mL 标准使用液，现用现配。

1.3.4 检测波长的确定

取3 只10 mL 比色管，分别加入0、0.5、1.0 mL CaO2标准使用液，再依次加入100 μL 季胺溶液、15 μL KI溶液、2 mL 磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）、Mb-Cu 溶液，蒸馏水定容至10 mL，置于50 ℃恒温水浴中10 min，进行紫外全光谱扫描。

1.3.5 反应条件的选择

以Mb-Cu 浓度（1.5×10-5～7.5×10-5mol/L）、季胺用量（0～200 μL）、KI 用量（0～30 μL）、反应温度（30～70 ℃）、体系pH 值（1～5）、反应时间（0～20 min）为变量，探讨其对催化反应体系显色的影响。

1.3.6 标准曲线的绘制

分别取标准工作液0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL 加入到10 mL 比色管中，再分别加入0.02 mol/L 季胺溶液60 μL、0.05 mol/L KI 溶液12 μL、50 μL Mb-Cu 溶液以及2 mL PBS 缓冲溶液（0.2 mol/L，pH4.7），蒸馏水定容至10 mL。50 ℃恒温水浴10 min，于462 nm 处测定其吸光度，以过氧化钙浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制过氧化钙标准曲线。

1.3.7 精密度与准确度的测定

准确称量1 g 小麦粉，加入10 mL 体积分数为1%的稀硫酸，搅拌均匀后，加蒸馏水定容至100 mL，混合均匀后转入离心管，以5 000 r/min 离心10 min，离心结束后吸取上清液8 mL，依次加入100 μL 季胺、15 μL KI、50 μL Mb-Cu 溶液、2 mL PBS 缓冲溶液，再于50 ℃水浴中反应10 min，于462 nm 处测定其吸光度，与标准曲线对比可读出过氧化钙的含量。加标浓度为100、200、400 mg/kg，试验以不添加过氧化钙的小麦粉作为空白样品，试验重复6 次，测定方法的精密度与准确度。过氧化钙含量的计算公式如下。

式中：C 为小麦粉中过氧化钙含量，μg/g；c 为标准曲线中过氧化钙的浓度，mg/L；m 为样品质量，g；10 为定容体积，L；100 为稀释倍数。

1.3.8 标准比色卡的制备

在最佳条件下进行显色后，使用颜色扫描器收集显色后的图像，使用Photoshop 将颜色按照渐变规律合成图像，制备过氧化钙标准比色卡。

1.4 数据处理

试验均重复6 次，采用SPSS 19.0 进行试验数据处理分析，采用Origin 8.5 进行绘图。

2 结果与分析

2.1 Mb 的表征

Mb 呈淡黄色液体，其在紫外-可见分光光度计的检测下吸收光谱如图1 所示。

由图1 可知，在258、302、338、398 nm 四处有明显吸收峰，表明Mb 结构完整。

2.2 Mb-Cu 的结合

图2 为Mb-Cu 配位的紫外-可见吸收光谱。

图2 Mb-Cu 配位的紫外-可见吸收光谱Fig.2 UV-visible absorption spectrum of Mb-Cu complex

由图2 可知，在紫外-可见分光光度计的检测下，随着Cu2+的加入，在338 nm 和398 nm 处的吸收峰值逐渐下降，说明Cu2+分别与Mb 中的4-羟基-5-硫酰咪（4-hydroxy-5-thioimidazole，HTI）和4-硫酰-5-羟基咪唑（4-thioyl-5-hydroxyimidazole，THI）结合，398 nm处吸收峰值降低说明Cu2+与THI 中的S 原子配位；338 nm 处吸收峰值降低表明Cu2+与HTI 基团中的S原子配位。当338 nm 和398 nm 处的吸收峰值下降停止时，表明配位结束，Mb 与Cu 配位完成，结合为Mb-Cu。

2.3 反应机理

CaO2与硫酸反应生成过氧化氢，在Mb-Cu 的催化下，以KI 为增敏剂可加快反应速度，提高反应效率，季胺作为反应底物被氧化并伴有显黄色反应，试验反应方程式如下。

总反应（1）+（2）+（3）+（4）+（5）为：

2.4 检测波长的选择

图3 为紫外光谱吸收曲线。

图3 紫外光谱吸收曲线Fig.3 UV absorption spectra of the color system

如图3 所示，不含CaO2标准溶液的曲线趋势平稳，无吸收峰出现，而含有CaO2标准溶液的2 条曲线在462 nm 处均出现较强吸收峰，且随着CaO2标准溶液含量的增加，其吸光度也随之增大，说明在462 nm 处该显色体系具有较高灵敏度，因此，测定波长为462 nm。

2.5 反应条件的优化

2.5.1 Mb-Cu 浓度对显色的影响

Mb-Cu 浓度对反应显色的影响，结果如图4 所示。

图4 Mb-Cu 浓度对显色的影响Fig.4 Influence of the Mb-Cu concentration on the absorbancy

由图4 可知，当Mb-Cu 浓度在0～4.5×10-5mol/L时，吸光度随着Mb-Cu 浓度的增加而增大，说明Mb-Cu 浓度越高，酶促反应进行的越快，当Mb-Cu 浓度超过4.5×10-5mol/L 时，吸光度呈下降趋势，说明此时酶促反应已经结束，当Mb-Cu 的浓度为4.5×10-5mol/L时，体系吸光度最高，因此Mb-Cu 的最适浓度为4.5×10-5mol/L。

2.5.2 季胺用量对显色的影响

季胺用量对显色的影响如图5 所示。

图5 季胺用量对显色的影响Fig.5 Influence of the quaternary ammonium dosage on the absorbancy

季胺作为反应底物，其用量在一定程度上会影响反应显色，如图5 所示，在季胺用量为0～60 μL 时，吸光度迅速增加，此时，季胺用量与吸光度成正比，吸光度随底物的增加而增大，当季胺用量超过60 μL 时，吸光度呈下降趋势，此时，酶以及增敏剂消耗完毕，底物过多会造成吸光度降低，因此，试验选取季胺用量为60 μL。

2.5.3 KI 用量对显色的影响

KI 用量对显色的影响如图6 所示。

图6 KI 用量对显色的影响Fig.6 Influence of the KI dosage on the absorbancy

KI 在体系中为增敏剂，可增加体系灵敏度，提高反应速度，如图6 所示，在0～12 μL 时，吸光度快速增加，说明在此区间内，KI 与反应速度成正比；在12～18 μL时，体系吸光度达到较高水平，此时反应已达到饱和；超过18 μL 时，吸光度逐渐降低，因此试验选取KI 用量为12 μL。

2.5.4 反应温度对显色的影响

反应温度对显色的影响如图7 所示。

图7 反应温度对显色的影响Fig.7 Influence of reaction temperature on the absorbancy

酶催化反应中，反应温度对酶催化速度产生重要影响，模拟酶通常可以通过提高反应温度加快反应速度，比天然酶更耐高温。由图7 可知，吸光度随着温度的升高而增加，50 ℃时到达最高，且温度过高Mb-Cu可能发生部分变性，最终导致失活，高温也易发生副反应，因此试验选择50 ℃作为反应温度。

2.5.5 pH 值对显色的影响

pH 值对显色的影响如图8 所示。

图8 pH 值对显色的影响Fig.8 Influence of pH on the absorbancy

由图8 可知，催化反应需要在适宜pH 值环境下进行，本试验选取pH 值范围为1～5，采用氢氧化钠调节pH 值，结果表明，pH 值对显色体系影响较小，可忽略不计，说明Mb-Cu 模拟酶不易受环境因素影响。因此，模拟酶催化反应可省略调节pH 值这一过程，使试验更加简便。

2.5.6 反应时间对显色的影响

反应时间对显色的影响如图9 所示。

图9 反应时间对显色的影响Fig.9 Influence of reaction time on the absorbancy

由图9 可知，体系吸光度在反应10 min 时达到最大，10 min 后几乎不变，因此反应时间为10 min。

2.5.7 标准曲线的绘制在最佳反应条件下，绘制的标准曲线如图10 所示。

图10 CaO2 标准曲线Fig.10 CaO2 standard curve

由图10 可知，体系中的CaO2浓度为0～10 mg/L时，CaO2浓度与462 nm 处的吸光度呈正相关。线性方程为y=0.078 1x+0.019 6，相关系数R2=0.997 6。计算得出标准偏差为4.75×10-4，检出限（limit of detection，LOD）为1.82×10-2mg/L（相当于2.25 mg/kg 小麦粉）。

2.5.8 精密度与准确度

加标回收结果如表1 所示。

表1 加标回收结果（n=6）Table 1 Results of spike recovery（n=6）

由表1 可知，平均加标回收率为99.21%～100.35%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.31%～1.22%，试验结果表明上述检测小麦粉中过氧化钙含量的方法具有良好的精密度和准确度。

2.5.9 标准比色卡

过氧化钙标准比色卡如图11 所示。根据反应后的颜色变化，可直接将过氧化钙含量与标准色卡进行比较，实现过氧化钙含量的可视化检测。

图11 CaO2 标准比色卡Fig.11 CaO2 standard colorimetric card

3 结论

本文建立并优化了甲烷氧化菌素模拟酶催化显色法测定小麦粉中过氧化钙的方法，根据过氧化钙与硫酸反应生成过氧化氢的原理，利用Mb-Cu 模拟过氧化物酶催化过氧化氢，并在碘化钾存在的条件下氧化季胺显色，建立了对小麦粉中过氧化钙含量测定的目视比色法，本方法可操作性强、操作步骤简单、结果可靠，适用于过氧化钙的检测。