气质联用仪测定食品中16种反式脂肪酸方法的研究

◎ 许蕤竹，虞太六

（上海华测品标检测技术有限公司，上海 201114）

食品中的脂肪酸可分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸两大类，不饱和脂肪酸由于含有双键，存在顺反异构体。反刍动物的油脂中含有天然反式脂肪酸，油脂的氢化加工过程也会产生反式脂肪酸。过量摄入反式脂肪酸会对人体产生很大的危害，众多研究表明，反式脂肪酸可能会引发冠心病、形成血栓、导致肥胖、引发糖尿病等，还会影响婴幼儿的生长发育。美国、丹麦等国家要求在食品标签上标注反式脂肪酸的含量[1]，中国香港也把反式脂肪酸作为核心营养素标注在食品包装上。《食品安全国家标准 预包装食品营养标签通则》（GB 28050—2011）中规定配料中含有氢化油、部分氢化油的产品，如人造奶油、植脂末、起酥油等，应标示反式脂肪酸含量。

目前国标中反式脂肪酸的检测标准主要是《食品安全国家标准 食品中反式脂肪酸的测定》（GB 5009.257—2016），该标准中规定了气相色谱法测试C16:1t-C22:1t等16种反式脂肪酸的方法。然而，脂肪酸的种类非常多，多种脂肪酸因结构近似，在色谱分析中保留时间相近或不能被分离，导致定性困难和定量不准确[2]。气质联用仪的应用将会很好地解决上述问题，通过色谱保留时间和质谱特征离子双重分析，即使在分离度不理想时也能够更加准确地定性和定量。气质联用仪测定反式脂肪酸的应用已有许多报道，但能够同时测定16种常见反式脂肪酸方法的研究很少见。本实验拟采用气质联用仪同时测定含动植物油脂的食品中16种反式脂肪酸，对前处理方法、仪器条件进行优化，建立一种数据准确可靠、操作简便、适用范围广的反式脂肪酸测定方法，作为对国标方法的补充。

1 材料与方法

1.1 试剂

盐酸（HCL）：分析纯；乙醚（C2H10O）：分析纯；石油醚：沸程30～60 ℃；无水乙醇（C2H6O）：色谱纯；氢氧化钾-甲醇溶液：2 mol·L-1；异辛烷（C8H18）：色谱纯；硫酸氢钠（NaHSO4）：分析纯。

1.2 仪器

气质联用仪：（Agilent 7890A-5975C），配自动进样器；恒温水浴锅；旋转蒸发仪；分析天平：感量0.001 g和0.000 1 g；离心机；涡旋振荡器。

1.3 标准品

16种反式脂肪酸甲酯混标（TMRM）见表1。

1.4 实验方法

1.4.1 食品中脂肪的提取和测定

称取待检测样品2～5 g（精确至0.001 g），置于100 mL具塞比色中，加入5～10 mL水充分混合，再加入8 mL盐酸，混匀。将比色管放入70 ℃水浴锅中，每隔10 min振摇一次，大约50 min试样完全水解，取出比色管，再加入10 mL乙醇混合，放置冷却。待温度降至室温后，往比色管中加入25 mL石油醚-乙醚溶液（1∶1，体积比），盖塞后充分振摇萃取，静置分层后，吸出上层有机相，置于100 mL具塞量筒中。往比色管中再加入25 mL石油醚-乙醚溶液（1∶1，体积比），按照前述萃取方法，重复再提取两次，合并有机相，用乙醚定容。精准移取50 mL有机相于蒸发皿中，50 ℃水浴蒸干，置于100 ℃下恒重，计算食品中的脂肪含量；剩余50 mL有机相经旋转蒸发掉溶剂后，得到的脂肪用于后续测试。

1.4.2 制备反式脂肪酸甲酯

称取50 mg脂肪，置于10 mL具塞比色管中，加入5 mL异辛烷溶解脂肪，再加入1 mL氢氧化钾-甲醇溶液（2 mol·L-1），涡旋混合均匀，放置反应约1 h，至比色管内液体澄清。往比色管中加入2 g硫酸氢钠，用来中和过量的氢氧化钾，用涡旋振荡器混合均匀，5 000 r·min-1离心10 min，取上清液用0.45 µm滤膜过滤，收集至进样瓶中，进气质联用仪测定。

1.4.3 仪器条件

（1）色谱条件。采用毛细管色谱柱SP-2560（聚二氰丙基硅氧烷）：100 m×0.25 mm×0.2 μm；载气流速：1.0 mL·min-1；进样口温度：260 ℃；程序升温：初始140 ℃（5 mim），以2 ℃·min-1升至230 ℃（20 min）；进样量：1 µL；分流比：20∶1。

（2）质谱条件[3]。电离方式：电子轰击（EI源）；电子能量：70 eV；离子源温度：200 ℃；四极杆温度：150 ℃；选择离子监测模式；溶剂延迟时间10 min。

（3）定量方法。面积归一化法。

2 结果与分析

2.1 脂肪测定前处理方法的选择

食品中常用的脂肪测定方法有酸水解法和索氏提取法[4]，酸水解法适用于大部分食品中脂肪的测定，索氏提取法不适用于结合态脂肪的测定。采用两种方法同时对脂肪标准样品进行测试，结果均在证书上给定的标准值范围内。比较两个方法的测定过程，索氏提取法耗时较长，所用试剂较多，且受限于设备，无法同时测定多个样品。综合考虑适用范围和测试成本、效率，本研究选用酸水解法来提取和测定食品中的脂肪含量。

2.2 甲酯化方法选择

脂肪酸属于高沸点物质，在色谱分析中需要将脂肪酸甲酯化，降低沸点，再进行仪器分析。常用的脂肪酸甲酯化方法有三氟化硼-甲醇法、氢氧化钾-甲醇法、浓硫酸-甲醇法等。三氟化硼-甲醇法和浓硫酸-甲醇法均需要在高温下冷凝回流，测试过程复杂，测试时间长，且三氟化硼有一定的毒性，浓硫酸也有很强的腐蚀性，操作危险系数较大。相比之下，氢氧化钾-甲醇法在常温下即可反应，操作简单、快速，危险性也较小。从反应效率角度分析，李培武等[5]研究发现三氟化硼-甲醇法和浓硫酸-甲醇法的酯化效率更高，更适合于绝对含量的测定，而氢氧化钾-甲醇法适合于相对含量的测定。本研究采用面积归一化法进行定量计算，所以更适合选用操作简便的氢氧化钾-甲醇法来制备脂肪酸甲酯。

2.3 色谱条件优化

SP-2560和HB-88同为脂肪酸测定专用柱，两种色谱柱均为强极性柱，对脂肪酸甲酯都有很好的分离度。本研究分别采用这两种色谱柱来分析16种反式脂肪酸甲酯标准溶液，通过不断尝试和调整升温程序，发现SP-2560对几种C18:3的反式脂肪酸的分离略优于HB-88，所以最终选择色谱柱为SP-2560。

2.4 定量、定性离子的选择

本研究先通过对16种反式脂肪酸甲酯标准溶液进行分析，通过全扫描来得到总离子流图，再根据保留时间和质谱特征确定定量、定性离子。定量、定性离子的选择结果与林麒等[6]的研究一致。各种反式脂肪酸甲酯的保留时间以及定量、定性离子见表2。

表2 各种反式脂肪酸甲酯的保留时间以及定量、定性离子表

2.5 定量方法选择

反式脂肪酸检测中的常用定量方法有外标法、内标法和面积归一化法等[7]。内标法和外标法适用于计算反式脂肪酸的绝对含量，面积归一化法是计算反式脂肪酸的相对含量，再利用食品中脂肪的含量数据来折算出食品中反式脂肪酸的含量。受限于反式脂肪酸的分离度等原因，内标法和外标法计算都会产生更大的误差。所以本研究采用面积归一化法进行检测结果的计算。

2.6 回收率以及精密度实验

以目标峰达到3倍信噪比的浓度来计算检出限，该方法的检出限为0.01%（以脂肪计）。通过空白基质3水平（10 mg·kg-1、50 mg·kg-1、100 mg·kg-1）6平行的加标实验，得到方法的回收率在81%～108%，RSD为3.1%～11.4%，见表3。该方法准确可靠，方法的回收率和RSD均符合《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）规定的检验方法确认要求。

表3 回收率以及精密度试验结果表

3 结论

本研究利用气质联用法对食品中16种反式脂肪酸进行检测，通过对比实验，选择用酸水解法提取脂肪，用氢氧化钾-甲醇法来制备脂肪酸甲酯，同时优化色谱、质谱条件，并采用面积归一化法进行计算，从而建立了一种便捷、高效的检测方法。通过大量实验数据分析表明，该方法准确，数据稳定。该方法为解决反式脂肪酸定性复杂这一难题提供了一种方案。