白藜芦醇通过AMPK/mTOR通路诱导白血病细胞自噬、凋亡的作用机制

章志学 王英 谢将 曾俊权 肖祎

(1吉安市中心人民医院,江西 吉安 343000;井冈山大学 2临床医学院;3数理学院)

由于造血干细胞的异常增殖,无法进行正常的分化凋亡等机制,造血组织内积累大量的异常分化细胞,进一步会浸润其他正常组织及器官,对机体正常的造血功能造成阻碍,从而导致了白血病的发生〔1〕。白血病是一种发生于血液系统的恶性肿瘤〔2,3〕,对人类生命健康安全造成了极大的威胁。目前临床对于白血病的治疗多采用阿糖胞苷、三氧化二砷、柔红霉素等化疗药物,但此类药物作用时往往缺乏特异性靶点,导致正常组织在治疗过程中受损,引起一系列不良反应,对患者造成极大的痛苦〔4〕,同时机体对化疗药物产生的耐药性也是白血病治疗的一大难点〔5,6〕,因此寻找更有效的抗白血病药物势在必行。当自然界植物遭受刺激时会产生一种多酚类抗毒素,即白藜芦醇,普遍存在于葡萄、虎杖、花生等植物中,研究发现,白藜芦醇具有消炎、抗菌、抗氧化、抑制肿瘤活性等多种药理作用〔7～9〕,白藜芦醇对肿瘤细胞凋亡、增殖等过程存在显著影响〔10,11〕,由此推测白藜芦醇可能对白血病存在治疗作用。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是控制能量代谢的重要因子,通过协调机体内部的多条代谢通路,以保持能量的平衡,AMPK/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路是参与能量代谢的一条重要通路,同时也是调节细胞自噬的重要通路,本研究探讨白藜芦醇通过AMPK/mTOR通路诱导白血病细胞自噬及凋亡的作用机制。

1 资料与方法

1.1细胞培养 白血病K562细胞系由中国协和医科大学提供,将细胞放置在培养基中培养至传代,取对数期细胞实验。

1.2试剂与仪器 白藜芦醇(纯度98%,厂家为西安格林生物科技有限公司);二甲基亚砜(DMSO,货号D2650,厂家为美国Sigma公司);噻唑蓝(MTT)试剂(货号M2128,厂家为美国Sigma公司);吉姆萨染色液(货号R20653,厂家为上海源叶生物科技有限公司);吖啶橙染色液(货号GL0329,厂家为北京百奥莱博科技有限公司);抗体p-AMPK(货号ab133448)、抗体p-mROR(货号ab109268)、抗体微管相关蛋白(LC3B;货号ab192890)、抗体半胱氨酸天冬酶(Caspase)-3(货号ab32351)、IgG二抗(货号ab150077)厂家均是英国Abcam公司;Cell Meter细胞自噬检测试剂盒(货号AAT-B23002,厂家为上海齐源生物科技有限公司);膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡检测试剂盒(货号40302ES20,厂家为上海翊圣生物科技有限公司);二喹啉甲酸(BCA)试剂盒(货号AR016,厂家为武汉博士德生物工程有限公司);XDS-900C型光学显微镜(厂家为上海蔡康光学仪器厂);CytoFLEX型流式细胞仪(厂家为美国Beckman公司)。

1.3细胞增殖能力检测 采用MTT实验,将细胞分为对照组、白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组(白藜芦醇浓度分别为0、100、200 μmol/L〔12〕),接种于96孔板,加入相应浓度的白藜芦醇处理1、3、6、12、24、48 h。向每孔滴加20 μl 5 mg/ml的MTT溶液,遮光培养4 h后吸取上清液并倒入200 μl DMSO溶液,进行充分振荡溶解,记录490 nm处细胞吸光值A,并得出细胞增殖抑制率(%)=(1-白藜芦醇处理组细胞A值/未处理组细胞A值)×100%,共进行3次。

1.4细胞形态观察 采用吉姆萨染色法观察细胞形态,取经相应浓度白藜芦醇处理24 h的白血病细胞,制成涂片并用甲醇进行固定,滴加吉姆萨染色液染色15 min,吸取剩余的染色液并将其洗净,显微镜下观察细胞形态。

1.5细胞凋亡能力检测 采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,将对数期分别接种于6孔板中培养,细胞贴壁生长后加入相应浓度的白藜芦醇继续培养24 h,使用冰箱内预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗净,根据试剂盒步骤说明进行操作,用流式细胞仪记录凋亡率,共进行3次。

1.6细胞自噬能力检测 采用吖啶橙染色法观察细胞自噬,取经相应浓度白藜芦醇处理24 h的白血病细胞,制成涂片并用甲醇进行固定,加入1 mg/L的吖啶橙染色液遮光染色20 min,吸取染色液并将其洗净,显微镜下观察细胞颜色。采用流式细胞仪检测细胞自噬率,将对数期分别接种于6孔板中培养,细胞贴壁生长后加入相应浓度的白藜芦醇继续培养24 h,使用冰箱内预冷的PBS洗净,根据试剂盒步骤说明进行操作,用流式细胞仪记录自噬率(%),共进行3次。

1.7细胞内相关蛋白检测 采用Western印迹,将对数期细胞分别接种于6孔板中培养,细胞贴壁生长后加入相应浓度的白藜芦醇继续培养24 h。加入蛋白裂解液提取总蛋白,在12 000 r/min条件下离心10 min得上部液体,采用BCA试剂盒检测其浓度,各组取该样品约30 μg进行电泳,蛋白分离后进行转移,用5%脱脂奶粉室温封闭1 h,放入经稀释的一抗(1∶1 000),在4 ℃的环境下培养至第2天,用PBS洗净后放入经稀释的二抗(1∶5 000),室温半小时再次用PBS洗净,显色显影后进行计算,共进行3次。

1.8统计学方法 采用SPSS20.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组细胞增殖能力比较 如表1所示,相较于对照组,经不同浓度白藜芦醇处理后的白血病细胞增殖抑制率均呈不同程度升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中高剂量白藜芦醇作用效果更明显,且随药物作用时间的增加其增殖抑制作用更明显。

表1 各组各时间点细胞增殖抑制率比较

2.2各组细胞形态比较 如图1所示,对照组白血病细胞细胞核大小均一,形态结构完整;白藜芦醇低剂量组白血病细胞细胞核出现不同程度皱缩,部分细胞形态出现破裂,出现存在凋亡小体的凋亡细胞;白藜芦醇高剂量组白血病细胞中凋亡细胞及破裂细胞数大量增加。

图1 各组细胞形态比较(吉姆萨染色,×400)

2.3各组细胞凋亡能力比较 如表2、图2所示,相较于对照组,经不同浓度白藜芦醇处理后的白血病细胞凋亡率均呈不同程度升高,其中高剂量白藜芦醇作用效果更明显,差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 各组细胞凋亡率比较

表2 各组细胞凋亡率、自噬率及细胞内相关蛋白表达比较

2.4各组细胞自噬能力比较 如图3所示,绿色细胞为正常细胞,橙色细胞为自噬细胞,对照组白血病细胞均为正常细胞,均未发生自噬;白藜芦醇低剂量组白血病细胞部分发生自噬,可在部分细胞内观察到明显的自噬小泡;白藜芦醇低剂量组白血病细胞内含自噬小泡的自噬细胞数量大量增加。如表2所示,相较于对照组白血病细胞,经不同浓度白藜芦醇处理后的白血病细胞自噬率均呈不同程度升高,其中高剂量白藜芦醇作用效果更明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。

图3 各组细胞自噬能力(吖啶橙染色,×400)

2.5各组细胞内相关蛋白表达比较 如表2、图4所示,相较于对照组白血病细胞,经不同浓度白藜芦醇处理后的白血病细胞内p-AMPK、LC3B蛋白表达呈不同程度升高,而p-mTOR、Caspase-3含量呈不同程度降低,其中高剂量白藜芦醇作用效果更明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。

1～3:对照组、白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组图4 Western印迹检测各组细胞内相关蛋白表达

3 讨 论

白血病作为一种极其恶性的造血系统疾病〔13〕,对于白血病的治疗临床多采用药物化疗的方法,其中大部分年轻患者症状会逐步缓解,但预后效果普遍较差,白血病患者的5年生存率仍低于40%〔14〕,且目前广泛使用的化疗药物不良反应明显,治疗往往伴随呕吐、出血、感染等症状〔4〕,对患者的身心带来双重伤害。中医是我国传统医学,主张辨证论治、整体观念,研究发现,中药在肿瘤治疗方面有很好的应用,一方面是因为其对肿瘤细胞明显的抑制作用,另一方面其作为天然化学药物具有毒副作用小的优势,中医药对肿瘤治疗有巨大的研究价值。

白藜芦醇是一种多酚类抗毒素,一般在植物收到紫外线、机械损伤、病毒感染等刺激时产生,白藜芦醇是研究发现的一种新型抗癌药物,对白血病也具有一定的治疗作用〔15〕,另外将白藜芦醇与化疗药物联用时能明显降低化疗药物的不良反应〔16〕。由于中药本身不是单一的化合物,其作用机制具有多通路、多靶点的特点,所以对于中药作用机制的研究也是科学研究的一大难点。马丽君等〔12〕研究发现白藜芦醇对白血病细胞具有明显的体外抑制作用,且对其细胞凋亡产生明显的促进作用,并推测其作用机制与下调C-myc癌基因及蛋白的表达有关;Yan等〔17〕则提出白藜芦醇对白血病细胞的抑制作用与诱导其细胞分化有关,其中向红系分化较明显。细胞自噬异常常与肿瘤的发展过程密切相关,肿瘤细胞需要通过细胞自噬维持内环境的稳定,而过度的细胞自噬会导致细胞死亡,也就是细胞凋亡过程,所以细胞自噬及凋亡在肿瘤细胞发展进程中发挥重要作用。李传翠等〔18〕指出,AMPK/mTOR可能影响白血病的发展进程。

本研究结果提示,白藜芦醇对白血病细胞能够产生明显的体外抑制作用,不同浓度的白藜芦醇处理的白血病细胞的增殖抑制率均显著增加,其中高浓度白藜芦醇的抑制作用明显高于低浓度,且随着白藜芦醇对白血病细胞处理时间的增长其抑制效果会逐步增强,与之前的研究结果相吻合,进一步证实了白藜芦醇对白血病的治疗作用。同时发现白藜芦醇对白血病细胞的抑制作用与其促进细胞自噬及凋亡有关,经白藜芦醇处理后的白血病细胞自噬及凋亡水平均有所增强,且高浓度白藜芦醇对白血病细胞自噬及凋亡两个生理过程产生的诱导作用更明显。结合相关文献推测其可能作用机制与AMPK/mTOR通路存在密切联系。本研究结果提示,白藜芦醇能够激活白细胞内的AMPK/mTOR通路,进而促进其下游通路LC3B等自噬蛋白的表达,促进细胞自噬过程,过度自噬激活细胞内的Caspase系统,加速Caspase-3对凋亡细胞的切割过程,从而加速其细胞的凋亡,那么白藜芦醇对白血病细胞的治疗作用可能就是通过该条通路实现的。

综上,白藜芦醇对白血病细胞自噬及凋亡过程具有明显的促进作用,其具体作用过程与AMPK/mTOR密切相关,未来还需通过进一步实验对本研究结果进行验证及深入研究,并且由于中药单药有效成分的复杂性,白藜芦醇体对白血病细胞的体外抑制作用可能涉及多条通路,未来还需深入研究。