miR-4433b-5p及SP-A在老年COPD患者病情严重程度及频繁加重风险中的价值

石雪峰 何响,2 孙泽蕊,2 王建祥 解友邦 多杰

(1青海省人民医院,青海 西宁 810001;2青海大学)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种气流受限不完全可逆,可预防和可治疗的疾病。老年COPD的发病率较高,且病情易反复,容易引起慢性肺源性心脏病等多种并发症,严重威胁老年患者的生命健康及生活质量。研究发现miRNA在肺部发育、成熟中具有促进作用,并且在肺功能的维持上也有一定作用〔1,2〕。有研究证明miRNA参与了多种呼吸系统疾病的生理病理机制〔3〕,说明miRNA在呼吸系统包括COPD发病过程中的重要性。基质金属蛋白酶(MMP)是锌/钙依赖性内肽酶,在细胞外基质重塑中起关键作用〔4〕,其在呼吸系统疾病如COPD和哮喘的发病机制中起至关重要的作用,可能具有重塑COPD患者气道的作用。多项研究亦表明肺泡表面活性蛋白(SP)-A参与了COPD的病理生理过程,并与COPD的急性加重具有相关性〔5,6〕,且研究认为肺泡表面物质释放入血可能与基质破坏有关。因此,本文通过收集老年COPD患者及健康体检者血浆进行高通量测序,以寻找差异表达miRNAs并进行生物信息学分析,根据筛选出差异表达的miR-4433b-5p检测老年COPD患者miR-4433b-5p、MMP-2 及 SP-A表达水平变化,探索其在老年COPD严重程度及未来急性加重风险中的临床意义。

1 对象与方法

1.1研究对象 经青海省人民医院伦理委员会批准,随机选取2019年1月至2020年1月在青海省人民医院(海拔2 260 m)就诊的健康体检者及COPD患者各50例,分别作为对照组及COPD组。两组分别随机选取5例进行高通量测序,为保证测序可行性,COPD组选取5例中重度COPD患者,为对照测序组和COPD测序组。从余45例样本中选取35例,对差异表达的miRNA进行验证并随访记录患者1年内急性加重次数,为对照验证组和COPD验证组。 根据急性加重次数将COPD验证组患者分为频繁组(≥2次/年)23例和非频繁组(<2次/年)12例。

1.2纳入及排除标准:COPD患者纳入标准:符合《GOLD 2017》〔7〕诊断标准,并除外其他引起气流受限的疾患。排除标准:(1)患有其他呼吸系统疾病,如哮喘等;(2)合并糖尿病、过敏性鼻炎、干燥综合征等其他内分泌、代谢、变态反应性及自身免疫性疾病;(3)合并肿瘤及严重其他系统严重原发病及并发症。

1.3试剂与仪器 血浆miRNA提取试剂盒购自天根生化科技公司,TRIzol购自美国 Invitrogen 公司;人SP-A试剂盒购自天津钧尧生物科技公司,人MMP-2试剂盒购自R&D systems公司;miR-4433b-5p引物、反转录及 qRT-聚合酶链反应(PCR)检测试剂盒购自美国 ABI 公司;紫外分光光度仪、7500qPCR仪分别购自美国Thermo公司、ABI 公司。

1.4肺功能测定及血气分析 肺功能测定采用日本杰斯特肺功能仪HI-101按照肺功能测定标准流程测定完成,血气分析采用Instrumentation Laboratory血气分析仪进行测定。由于血气分析采集动脉血且疼痛明显,大部分入试者不愿进行,仅对COPD组采集动脉血检测。

1.5miRNA测序及筛选 对照组及COPD组各 5 例样本进行miRNA测序,由北京博奥晶典有限公司完成。从测序结果中筛选老年COPD差异表达的 miRNAs,差异表达采用显著性P值和差异倍数(FC)两个指标来判断:(1) miRNA表达上调标准:P≤0.05且 FC≥2;(2) miRNA表达下调标准P≤0.05且FC≥2。

1.6qRT-PCR检测血浆miR-4433b-5p表达 用Triozol LS提取血浆样本miRNA,并用分光光度计检测提取到的RNA浓度及纯度。以U6为内参,用Taqman MicroRNA 反转录试剂盒说明书及特定引物进行miRNA的反转录及qRT-PCR测定,循环数为45个循环, 以2-ΔΔCt计算miR-4433b-5p相对表达量。

1.7酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆SP-A及MMP-2浓度 严格按照试剂说明书进行血浆SP-A及MMP-2浓度测定。顺序按3个复孔加入标准品、空白对照孔及标本样本,随后加酶、温育、洗涤、显色、终止,在450 nm波长处测吸光度(OD)值。根据结果绘制标准曲线后根据OD值计算样本浓度。

1.8统计学方法 采用SPSS19.0软件进行χ2检验、t检验、Kruskall-WallisH检验、Pearson相关性分析及Spearman相关性分析。检验水准取α=0.05。

2 结 果

2.1一般资料 COPD测序组与对照测序组年龄分布、性别组成及吸烟史无明显差异(P>0.05);而第1秒用力呼气量占预计值百分比(FEV1)%预计值及FEV1/用力肺活量(FVC)明显降低(P<0.05)。COPD验证组与对照验证组年龄分布、性别组成及吸烟史亦无明显差异(P>0.05)。COPD频繁组和非频繁组年龄、性别及吸烟史均无统计学意义(P>0.05)。见表1、表2。

表1 测序样本各组间一般资料比较

表2 验证样本及频繁样本各组间一般资料比较

2.2测序样本差异表达miRNA及筛选 老年COPD测序组与对照测序组相比,差异表达的miRNAs有159个,其中上调53个,下调106个。COPD差异表达miRNAs热图,见图1。

图1 老年COPD差异 miRNAs 聚类(miRNA TPM,热图)

2.3差异表达miRNAs靶基因预测及信号通路分析 从富集结果中选取校正后CorrectedP值最小的前30个条目绘制富集通路分析条形图。选择以e为底的CorrectedPe值的对数为横坐标,横坐标值越大,CorrectedP值越小,说明该差异基因在该条目中越富集。通过miRanda 软件对差异表达的miRNAs的靶基因进行预测,每个miRNA取预测结果的前10名,最终将老年COPD患者差异表达的miRNAs预测到2 999个靶基因。将预测的靶基因进行信号通路分析,结果显示信号通路主要集中于神经生长因子(NGF)信号、轴突导向、基因表达、基因转录通路、细胞质膜酪氨酸激酶相关受体(RTKA)/NGF信号通路及多个成纤维细胞生长因子受体(FGFR)等信号通路,见图2。

图2 两组差异表达miRNAs的靶基因Pathway富集分析条形图

2.4差异表达的miRNAs筛选及验证 为进一步缩小差异表达miRNAs范围,本研究以log2FC≥2,且P值≤0.05进行筛选,得到如表3所述的31个差异表达miRNAs,其中上调12个,下调19个。另外,鉴于miRNAs主要通过下游靶基因起调控作用,且阻塞性肺气肿为COPD的基本病理变化,本研究拟对COPD的细胞外基质(ECM)调控机制进行探索,故应用targetscan网站进行差异miRNA的靶基因预测,筛选出下游靶基因为MMP的miRNAs。如表3所示,共筛选出9个miRNA下游靶基因为MMP。鉴于MMP-2属于明胶酶A,主要水解变性胶原及基膜的主要成分Ⅳ型胶原,靶基因预测MMP-2为hsa-miR-4433b-5p的靶基因,结合目前尚未有COPD中hsa-miR-4433b-5p表达情况的报道,因此选取hsa-miR-4433b-5p在中海拔COPD患者中进行下一步的验证。与对照组验证相比,miR-4433b-5p在COPD验证组中表达明显降低(P<0.01),这与测序结果一致。见图3。

图3 两组miR-4433b-5p、MMP-2、SP-A表达水平

表3 差异表达miRNA及可能的MMP靶基因

2.5两组miR-4433b-5p、MMP-2、SP-A、 FEV1%预计值及FEV1/FVC比较 与对照验证组相比,COPD验证组血浆MMP-2、SP-A浓度均明显升高(P<0.01),miR-4433b-5p、FEV1%预计值及FEV1/FVC均明显降低(P<0.05)。见图3、表4。

表4 两组miR-4433b-5p、MMP-2、SP-1、FEV1%预计值及FEV1/FVC比较

2.6血浆miR-4433b-5p、MMP-2及SP-A与老年COPD严重程度相关性 将老年COPD患者血浆miR-4433b-5p、MMP2及SP-A与COPD严重程度评估指标FEV1%预计值及1年急性加重次数进行相关性分析,结果显示血浆miR-4433b-5p与FEV1%预计值呈显著正相关(r=0.429,P<0.05),而与1年急性加重次数呈显著负相关(r=-0.455,P<0.05)。血浆MMP-2及SP-A与FEV1%预计值呈显著负相关(r=-0.462,P<0.01;r=-0.422,P<0.05),与1年急性加重次数呈显著正相关(r=0.427、0.429,均P<0.05)。

2.7改良版英国医学研究学会(mMRC)呼吸困难指数、血浆miR-4433b-5p、MMP-2及SP-A对COPD频繁加重风险评估 对mMRC呼吸困难指数、血浆miR-4433b-5p、MMP-2及SP-A行二元Logistic回归分析,结果仅血浆miR-4433b-5p及SP-A进入了二元Logistic单因素回归方程,可作为老年COPD频繁加重风险评估指标。见表5。

表5 血浆miR-4433b-5p、MMP2及SP-A二元Logistic单因素回归分析

2.8受试者工作特征(ROC)曲线预测老年COPD急性加重风险 miR-4433b-5p联合SP-A预测老年COPD频繁加重风险的灵敏度、曲线下面积(AUC)均高于SP-A、miR-4433b-5p单独预测。见表6、图4。

图4 ROC曲线评估COPD频繁加重风险

表6 老年COPD未来急性加重风险评估

3 讨 论

据估算,至2015年全球有多达73亿例COPD患者〔7〕,而至2012年有超过300万人死于COPD,占全球死亡的6%,是目前全球第四大死亡原因,预计到2020年将成为第三大死因〔8〕。而年龄、性别、吸烟均为COPD的危险因素〔9〕,研究显示老年COPD患者发病率及死亡率均比较高,其仍然是未来数十年全球主要公共负担〔10〕。

研究证明,miRNA在COPD等肺部疾病的发病中可能具有一定的调控作用〔11,12〕。本研究miRNA测序结果显示,miRNAs可能参与了COPD的病理过程,通过miRNAs靶基因预测及生物信息学分析显示靶基因主要富集在NGF、FGFR等信号通路上。富集信号通路的发现为COPD发病机制的研究及探索新的治疗药物提供了重要依据。

ECM降解是COPD的主要特征,伴随ECM被不同的MMP降解从而导致肺气肿发生,从而导致COPD〔13〕。为明确miRNA是否可以通过调控MMP的表达参与COPD的发病过程,本研究对差异表达miRNAs通过targetscan进行靶基因预测,筛选作用于MMPs的miRNAs,共筛选出9个miRNAs。通过调阅文献发现MMP-2在COPD肺气肿等的病理进展过程中具有重要调控作用〔14,15〕,是目前研究最多的MMPs之一,且靶基因预测提示MMP-2为miR-4433b-5p的靶基因。本研究显示,血浆MMP-2的表达在老年COPD患者血浆中表达高于对照组健康体检者,且老年COPD患者血浆miR-4433b-5p表达降低,这与测序结果一致。结合靶基因预测显示MMP-2为miR-4433b-5p的靶基因,推测miR-4433b-5p可能通过调控MMP-2调控COPD肺气肿等病例进程。而MMP-2表达上调可能造成肺ECM破坏,极有可能导致肺泡表面活性物质入血增多。肺泡表明活性物质SP-A是由肺泡Ⅱ型上皮细胞及Clara 细胞合成分泌的,据文献报道SP-D除了有维持肺泡表面稳态及肺部免疫平衡的作用,还具有抵御病毒感染、清除细菌、抑制炎症反应等作用,并且其血清水平可以有效评估COPD患者病情严重程度〔16〕。本研究结果与既往研究一致。

本研究结果显示,血浆miR-4433b-5p、MMP-2及SP-A均与FEV1%预计值及过去1年急性加重次数具有相关性,推测miR-4433b-5p表达降低者、血浆MMP-2及SP-A浓度升高者, 其老年COPD严重程度增加。鉴于此,本文推测血浆miR-4433b-5p、MMP-2及SP-A可能用于辅助COPD的严重程度评估。本研究还提示,仅血浆miR-4433b-5p及SP-A纳入方程可作为老年COPD未来急性加重风险的危险因素,两标志物联合评估效果最佳。

综上,老年COPD患者血浆中miR-4433b-5p表达降低、血浆miR-4433b-5p及SP-A可作为老年COPD患者严重程度评估及未来急性加重风险的危险因素。miR-4433b-5p可能通过调控MMP-2调控COPD病理学过程。不足之处为需要扩张样本量进行对未来急性加重风险预测界值进行明确。另外,MMP-2是否为miR-4433b-5p的靶基因及miR-4433b-5p调控COPD病理过程机制及miR-4433b在COPD进展中的调控作用需进一步研究。