镉胁迫下广藿香幼苗的生理响应

李莹莹, 何梦玲, 姚尹伊, 黄焕超, 严寒静, 张宏意

(广东药科大学中药学院, 广州 510006)

藿香[Pogostemoncablin(Blanco) Benth.] 为唇形科刺蕊草属的多年生草本,以干燥地上部分入药,主要含百秋李醇、广藿香酮等成分,具芳香化浊、开胃止呕、发表解暑等功效[1]。广藿香广泛用作中成药原料,是藿香正气水、抗病毒口服液等三十余种中成药的主要成分。此外,广藿香也是化妆品、定香剂和杀虫剂等多种其他轻化工产品的重要原料[2]。目前药用植物栽培中重金属污染问题较为普遍,其中镉污染问题尤为严重。镉是土壤中分布最为广泛且毒性较强的重金属之一[3],当土壤中的镉被植物吸收并超过一定阈值时,可引起植物产生应激的生理生化反应,植物细胞膜系统被氧化破坏,植物生长受制,甚至可导致植物死亡。如种子萌发、植物生长、以及植物光合效率受到抑制、改变植物对土壤离子的吸收速率等。此外,在重金属镉胁迫下,植物次生代谢产物的合成以及相关基因的表达也会发生相应的改变[4-6]。

依据商务部于2001年颁发的《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》(WM/T2—2004)中有关药用植物的重金属限量标准,张俊清[7]检测了海南广藿香中重金属含量,发现海南万宁、东方及琼海三产区的广藿香样品中Cu、Pb、Cd存在不同程度的含量超标。黄伟展等[8]测定了10个产区广藿香药材及其生境土壤中的重金属含量,结果发现镉是广藿香土壤生境中主要的重金属污染物之一。目前土壤重金属污染日益严峻,会对植物的正常生长发育带来影响。如延缓种子萌发,抑制植物根、茎的伸长等[9]。同时,重金属胁迫还会改变植物体内糖和蛋白质的代谢,增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量,对植物造成极大的损害[10-11]。此外,若药用植物种植在重金属超标的土壤中,可能会使重金属富集在植株体内,并通过食物链最终损害人类和动物健康[12-13]。

在现有研究的基础上,现通过在土壤中添加6种不同浓度镉溶液的方法胁迫广藿香,并于处理后1、10、20、30 d 共4个时间点检测其9个生理指标的含量,对镉胁迫下广藿香的生理响应特征进行研究。以此为基础深入研究广藿香吸收以及转运Cd的关键基因提供研究基础,并为筛选培育镉吸收少、富集少的品种提供理论依据,同时为研究耐Cd广藿香及其他中药材品种的培育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与处理

供试材料为广藿香幼苗,经广东药科大学何梦玲副教授鉴定为唇形科植物广藿香Pogostemoncablin(Blanco) Benth.,实验地点位于广东药科大学大学城校区中药学院。选取生长两个月且状态近似的广藿香幼苗,种植于混合土壤(黄泥土、营养土)中,在土壤中混入0、25、50、100、150、200 mg/kg的CdCl2水溶液,阴干后作为栽培土壤使用,每组10个重复。

1.2 方法

1.2.1 株高、鲜重的测定

处理第1、10、20、30天后,用电子秤称量每个样品的鲜重;用卷尺测定每个处理组的株高,规定土上部分的高度即为株高。

1.2.2 抗氧化酶活性的测定

处理第1、10、20、30天后,用随机混取法采集形态学上端第二、三对叶片作为研究材料,在液氮速冻后,置-80 ℃冰箱保存备用。

根据超氧化歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性测定采用氮蓝四唑法[14]和过氧化物酶(peroxidase,POD)活性测定采用愈创木酚法[14],取保存的叶片组织于预冷的研钵,按照样品:磷酸缓冲液(pH 7.5)1∶4的比例进行研磨,制成匀浆后,转入离心管中,4 ℃、12 000 r/min下离心20 min,上清液即为酶粗提液。

1.2.3 可溶性蛋白、丙二醛及过氧化氢含量的测定

可溶性蛋白(total protein,TP)含量测定采用考马斯亮蓝法[14];丙二醛含量(malondialdehyde,MDA)测定采用硫代巴比妥酸法[14];过氧化氢(H2O2)含量测定采用分光光度法[14]。

1.2.4 叶绿素含量的测定

处理第1、10、20、30天后,采集广藿香植株第二对叶片,按照样品的质量m与95%乙醇体积V的比例为m∶V= 1∶50,避光处理24 h后,在649 nm和665 nm的波长下测定溶液的吸光度值A649和A665[13]。叶绿素C含量计算公式为

C=(17.16A649+6.63A665)V/(100m)

(1)

式(1)中:C为叶绿素浓度,nmol/mg prot;V为溶液体积,L;m为样品质量,g。

1.3 广藿香指标性成分含量的测定

处理第1、10、20、30天后,采收每个处理组的样品,室温阴干后,采用气相色谱-质谱联用仪(安捷伦,美国,7890 B-7000 D)联用的方法对广藿香样品中百秋李醇、广藿香酮含量进行测定,测定参照罗可可[15]的方法。

1.4 统计分析

采用SPSS 23.0 2019 (IBM Inc.,美国)对实验结果进行统计分析,使用OriginPro 2019 b对数据进行作图。

2 实验结果与讨论

2.1 Cd胁迫对广藿香植株农艺性状的影响

镉胁迫下广藿香株高的变化如图1所示。所有组别的植株株高均有增长,但处理组与对照组相比较,增长率降低。其中对照组株高增长量达9.51%,处理组(25、50、150 mg/kg组别)株高增长率分别为8.98%、6.93%、7.76%,处理组(100、200 mg/kg组别)株高增长率为4.15%、2.31%。与对照组株高具有显著性差异。Cd对植物有较高的毒性。广藿香植株的株高都有增长,但处理组增长量远小于对照组,说明镉胁迫会抑制植株的生长发育,且随着镉胁迫浓度的增大,抑制效果更明显。研究发现重金属离子能通过阻止初生分生组织中的细胞分裂来影响植物形态的变化[16]。

同一处理时间不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05);样品数n=3

镉胁迫下广藿香鲜重的变化如图2所示。对照组鲜重始终呈上升趋势,50、100 mg/kg的Cd胁迫的处理组植株鲜重虽然在处理初期有升高趋势,但所有处理组鲜重最后均呈下降趋势。镉胁迫1 d后,各组的鲜重没有显著性差异,胁迫30 d后,对照组、25、50 mg/kg处理组与100、150、200 mg/kg处理组植株鲜重具有显著性差异。Sahoo等[17]的研究结果表明,受到重金属胁迫后,植物会减少对水分和养分的吸收,从而影响蒸腾作用、光合作用、呼吸作用等生理过程,最终抑制植物生长。对照组鲜重随胁迫时间的延长逐渐升高,所有处理组的植株随着镉胁迫时间的延长,其鲜重均呈下降趋势,其中高浓度处理组(150、200 mg/kg)30 d后鲜重降低至初始鲜重的40.14%、50.60%;而低浓度处理组(50、100 mg/kg)在处理初期,广藿香植株的鲜重有一定程度的增长,说明低浓度的重金属胁迫有一定程度的生长促进作用;这与何雪等[18]在镉对马铃薯植株生长影响的研究结果一致。Farzadar等[19]发现,洋甘菊将重金属Cd吸收至地上部分后,可能会导致地上器官中生长因子的减少,这可能也是广藿香在胁迫后期鲜重降低的原因。

同一处理时间不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05);样品数n=3

2.2 Cd胁迫对广藿香抗氧化酶活性的影响

镉胁迫下广藿香叶片抗氧化酶活性变化如图3和图4所示。其中SOD酶活性变化见图3,POD酶活性变化见图4。可以看出,对照组SOD酶活性整体呈上升趋势,除高浓度200 mg/kg Cd胁迫下SOD酶活力为下降趋势外,其他处理组SOD酶活力均先升高后降低。对照组POD酶活力略有下降,但整体呈平稳趋势,低浓度25 mg/kg镉胁迫的处理组POD酶活力在试验期间整体呈升高趋势,其他处理组均呈现先升高后降低的趋势。镉胁迫过程中,不同浓度处理组的广藿香抗氧化酶活性均有上升的时间段,低浓度处理组促进作用没有高浓度处理组反应迅速,同时高浓度处理组的镉胁迫的抑制作用也会更明显。

同一处理浓度不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05);样品数n=4

同一处理浓度不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05);样品数n=4

2.3 Cd胁迫对广藿香可溶性蛋白、丙二醛以及过氧化氢含量的影响

镉胁迫下广藿香植株的可溶性蛋白含量变化见图5,MDA含量变化见图6,H2O2含量变化如图7所示。对照组可溶性蛋白含量前20 d呈上升趋势,20～30 d时下降。25 mg/kg Cd处理组可溶性蛋白含量整体呈上升趋势,50、100、200 mg/kg Cd胁迫下可溶性蛋白含量呈下降趋势,但整个实验过程中各个组别各个时间点样品并没有产生显著性差异。所有组别的叶片MDA含量随着胁迫时间的延长总体呈上升趋势,处理10 d后,150、200 mg/kg处理组MDA含量与对照组有显著性差异,处理30 d后,150、200 mg/kg处理组MDA含量与对照组有显著性差异。H2O2含量变化趋势整体与MDA含量变化趋势相近。对照组H2O2含量随时间的延长有较小程度的增长,其他各组H2O2含量均呈明显的上升趋势。对照组叶片在第一天时H2O2含量较高,在初期,镉浓度越高H2O2含量越少,随着胁迫时间的延长,200 mg/kg处理组在第30天时H2O2含量最高,增幅最大。

同一处理浓度不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05);样品数n=4

同一处理浓度不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05);样品数n=4

同一处理浓度不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05);样品数n=4

2.4 Cd胁迫对广藿香植株叶绿素含量的影响

镉胁迫下广藿香植株的叶绿素含量变化情况见图8。25 mg/kg重金属Cd胁迫下广藿香叶绿素含量在第10天时降低,后又升高;50、200 mg/kg重金属Cd胁迫下广藿香叶绿素含量在第10天时升高,后又降低。100、150 mg/kg重金属Cd胁迫下广藿香叶绿素含量随着胁迫时间的延长持续降低。镉胁迫处理30 d后,对照组叶绿素含量与100、150、200 mg/kg处理组广藿香植株的叶绿素含量产生了显著性差异。

同一处理浓度不同小写字母表示差异达显著水平(P<0.05);样品数n=4

重金属胁迫会影响叶绿素含量。有研究认为重金属进入植物组织后,会直接干扰叶绿素的生物合成,重金属离子会使叶绿素酶的活性升高,从而造成叶绿素分解速度加快[32]。叶绿素生长代谢基础是光合作用,其含量直接影响植物正常的新陈代谢效率[33-34]。植物叶绿素含量降低,光合作用的效率也会受到抑制[35-36]。随着胁迫时间的延长和胁迫浓度的增加,广藿香叶绿素含量的增长受到明显的抑制作用,这与Cd2+胁迫对桑树光合作用的影响结果基本保持一致[37]。

2.5 Cd胁迫对广藿香植株指标性成分含量的影响

由表1可知,不同浓度镉胁迫后,百秋李醇含量呈上升趋势,广藿香酮含量呈下降趋势。处理第1天时,对照组与25、100、150、200 mg/kg处理组百秋李醇含量均有显著性差异,处理第30天后,对照组与25、100 mg/kg处理组百秋李醇含量仍具有显著性差异,但是与150、200 mg/kg的处理组不再具有显著性差异。处理30 d后,对照组广藿香酮含量减少了40.46%,其他处理组广藿香酮含量分别减少了18.01%、39.93%、29.72%、57.58%、44.69%,有镉胁迫浓度越高广藿香酮减少量越大的趋势。25 mg/kg处理组广藿香酮含量与对照组具有显著性差异。

表1 不同镉浓度处理时间下广藿香植株指标性成分含量的变化(n=3)

重金属Cd胁迫下可能会造成广藿香植株体内次生代谢产物合成以及相关基因的表达都会发生相应的改变[38]。广藿香植株受到重金属胁迫后,百秋李醇含量虽然有所增加,但与对照组相比增长量明显减少,推测是Cd不同程度地抑制了合成途径中次生代谢产物的合成。所有处理组别广藿香酮含量都减少,因为百秋李醇和广藿香酮合成中有共同的基因参与[39],因此广藿香酮含量的减少既有在生长过程中,由于百秋李醇的增加而减少,也有受到Cd胁迫影响下的减少。目前关于重金属胁迫下药用植物有效成分含量的变化研究较少,重金属胁迫下广藿香有效成分含量变化的原因尚有待进一步研究。

3 结论

运用具有药用价值的广藿香作为原材料,探讨了其在镉胁迫下形态和生理指标的变化,更加深入研究了其药用有效成分的含量变化,为中成药研究奠定了理论基础。

(1)镉对广藿香株高具有显著(P<0.05)抑制作用;在Cd胁迫25、50、100 mg/kg处理组,对广藿香鲜重具有先促进再抑制的作用,在Cd胁迫150、200 mg/kg处理组下对广藿香鲜重具有显著(P<0.05)抑制作用。

(2)镉对广藿香胁迫初期会激发广藿香本身的抗逆能力,SOD酶活力在镉25、50 、150 mg/kg作用下和POD酶活力在镉25、100、150、200 mg/kg作用下,在1～10 d,均有不同程度的上升,在10～30 d,均有不同程度下降的趋势,随着胁迫浓度的增加和胁迫时间的延长,抗氧化酶系统受到抑制,无法完全解决重金属胁迫带来的伤害,植株自身的生长会受到抑制,抗氧化酶活性会降低。

(3)25 mg/kg Cd处理组对广藿香中可溶性蛋白含量整体呈上升趋势,其他处理组Cd胁迫下可溶性蛋白含量呈下降趋势;MDA含量随着胁迫时间的延长总体呈上升趋势,处理30 d后,150、200 mg/kg处理组MDA含量与对照组有显著性差异;随着镉胁迫时间的延长,200 mg/kg处理组在第30天时H2O2含量最高,增幅最大。

(4)镉对广藿香叶绿素含量具有显著(P<0.05)减少作用,镉胁迫处理30 d后,对照组叶绿素含量与100、150、200 mg/kg处理组广藿香植株的叶绿素含量减少量最大。

(5)镉对广藿香的次生代谢产物也会受到影响,百秋李醇含量呈上升趋势,但与对照组相比增量明显减少。广藿香酮含量呈下降趋势。处理30 d后,对照组广藿香酮含量减少了40.46%,其他处理组广藿香酮含量分别减少了18.01%、39.93%、29.72%、57.58%、44.69%,有镉胁迫浓度越高广藿香酮减少量越大的趋势。

综上所述,镉胁迫会对广藿香生理状态造成影响,且在低浓度、短时间镉胁迫下,广藿香生理状态被激活,高浓度、长时间的镉胁迫下,广藿香生理状态受到抑制。