化学发光免疫检测在生化检验中的应用

＊冯 淼

（郑州工业应用技术学院 河南 451100）

化学发光免疫检测法为借助磁场分离抗体以及抗原的沉淀和游离部分，针对检测目标进行定性及定量的一种检测方式，在临床上也可将其称为化学发光标记免疫测定法，当前已经可以在心脏疾病、病毒标志物、临床肿瘤、免疫系统疾病的诊断和治疗当中广泛应用[1]，特别是在针对甲状腺疾病进行诊断时，检测内容重点之一即为甲状腺球蛋白浓度，但若仅采用常规的检测方式，不仅假阴性和假阳性的检出率较高，且难以为后续的临床治疗方案设计工作提供指导，所以有必要针对化学发光免疫检测在生化检验中的应用进行深入分析。

1.化学发光免疫概述

化学发光免疫分析即为发光分析和免疫反应结合应用所构建起的微量抗原以及抗体新型标记免疫分析技术，其中经典的标记技术为荧光免疫技术、放射免疫技术、发光免疫技术、酶免疫技术，在原子中的电子或是分析吸收能量以后，电子或是原子可以由基态跃迁至激发态，之后再返回到基态中，并对光子进行释放，技能呈现出发光的现象。其中的基本原理为针对抗原或是抗体标记化学发光物或酶标志物，其中产生免疫反应以后，将复合物置入到氧化剂或者化学发光剂中，使其发光，并对其发光强度进行检测，同时计算待测浓度。一般来说，应使用有机化合物作为化学发光物，并借助氧化反应促使其发光[2]。

按照分子能量来源，可以将其划分成为光照发光、生物发光以及化学发光，并且化学发光还可被划分成为直接和间接两个类型。在化学反应可以释放充足的能量促使参与反应的物质进入到激发态时，如果被激发的对象为反应产物分子，则这一过程为直接化学发光，如果激发传递至另一未参加化学反应的分子D上，促使D分子进入到激发态，即为间接化学发光[3]。该方法自20世纪70年代开始应用于临床，当时主要作为示踪信号，但是因为灵敏度较差、发光时间较短，所以应用过程中限制较多。目前我国医学相关技术快速发展，在辣根过氧化物酶标技术应用越来越广泛的同时，化学发光免疫检测技术的发光时间延长且信号强度提升，既往存在的不足之处已经得到显著改善。

2.化学发光免疫检测的应用价值

化学发光免疫检测法属于当代临床生化检验工作中应用频率较高的一类检测方法，可以在病毒检测、心脏病检测等多个方面进行应用，具体情况如下：

（1）肿瘤标志物的检测：机体组织及细胞内均存在蛋白质、酶、激素等多种肿瘤标志物，针对其进行检测，可以为患者的早期诊断以及预后水平的监测提供重要依据，例如，检测鳞状细胞癌抗原以及细胞角蛋白19的可溶性片段（cy-fra21-1）浓度即可为食管癌进行诊断和观察病情变化，且应用效果较好。

（2）心脏疾病的检测：心脏病的发生与发展均与肌红蛋白以及心肌损伤标志物之间具有密切关联性，所以可以针对二者进行检测，可以准确诊断心脏疾病患者，并能够对其临床症状变化情况进行准确、及时的监测。

（3）乙肝病毒标志物检测：既往针对乙型病毒性肝炎患者，主要使用ELISA法进行定性检测，但是无法满足临床上的定量要求，而当前进行病毒感染情况判断时，可以选择将乙肝表面抗原（HBsAg）作为主要标志物，以能够同时满足定性和定量的要求，并且相应的灵敏度、特异性和准确性较高[4]。

（4）梅毒螺旋体检测：针对患者机体内的非密螺旋体特异性抗体进行检测，之后还需进行一次确证检测，将两次检测结果结合应用方可确诊，临床上实际检测梅毒螺旋体的过程中，如果采用人工检测的方式，不仅效率较低，且操作过程复杂，无法满足多项临床要求，而在其中使用化学发光免疫检测法，可以应用全自动分析仪，有效降低其中的假阳性率，也就可以提升临床诊断结果的准确性。

3.化学发光免疫检测在生化检验中的应用

(1)快速化学发光免疫分析方法

若采用传统的免疫分析方法，不仅需要耗时数个小时，且在温育过程中，免疫试剂极易吸附于管壁上，并导致不同类型的测定信号之间发生交叉，接着能够使样品检测通量受到限制，同时免疫分析方法的实际使用效果也能受到影响。此时可以采用外场驱动的方式或是有效混合溶液的方式，促使抗体、抗原等不同的生物大分子提升传质速率，或是促使反应体系温度提升，以强化免疫反应的动力学，也就可以实现免疫检测效率的提升[5]。

在实际应用快速化学发光免疫分析方法的过程中，可以选择使用超声波驱动、改变电渗流、电磁搅拌、电场驱动等多种方式提升传质速率，特别是采用磁场富集与电场驱动相结合的方式构建起微流控器件，并将一定的电压施加于流通池内，促使包含电荷的待测物逐渐移向微阵列表面，且在进行温育时，因为分子探针中含有磁珠，所以可以借助磁铁将其富集于微阵列表面，整体上来看，实现了双重加速，且整个过程耗时最多3min。

在进行外力驱动过程中，需要借助附加设备实现加速，例如在进行免疫反应时，借助附加设备将氮气匀速通入到其中并形成微气泡，可以缩短温育时间约50%，并且微气泡加速免疫反应措施的成本低廉、过程简洁，分析流程整体仅需耗时16min，如图1所示[6]。

图1 微气泡加速化学发光免疫分析法示意图

(2)电化学发光免疫分析方法

电化学发光技术（ECLI）为最近几年受到重视的一项先进技术，可在物质分析工作中作为痕量分析手段，当前已经能够在临床疾病诊疗或是基础医学研究中得到广泛应用，发展前景良好。目前ECLI的主要生产厂家为瑞士罗氏公司，其中的ROCHE/2010型电化学发光分析系统不仅功能齐全，且操作便捷、分析灵活、稳定性良好，同时分析速度较快，十分适合在临床实验中应用。

从实际上来看，电化学发光免疫分析的过程包含电化学以及化学发光两个部分。先由电启动发光反应，以针对反应实施精准的控制，使用[Ru(bpy)3]2+作为标记物，标记物生物分子及配体发生具有特异性的结合反应之后，共同进入到流动测量室当中，电发光过程同时被启动。这一过程主要可以分为以下几个部分：①含有三丙胺（TPA）缓冲液进入测量室，电极针对其加电；②发光剂[Ru(bpy)3]2+以及电子供体TPA各在阳极表面失去一个电子，并且失去时间相同；③二价[Ru(bpy)3]2+经过氧化成为三价，TPA经过氧化成为TPA+，因为阳离子自由基稳定性严重不足，所以自发失去质子并转变成为自由基TPA，其还原性较强，能够对外释放电子三价标记物，接收电子后可形成激态Ru2+，在荧光机制的影响之下发生衰减，后续可发出光子，光子波长为620mm，并再次形成基态Ru。后续只要出现加电现象，电极表面即能持续产生光子，Ru浓度与光强度之间具有线形关系[7]。

将该方法应用于甲状腺肿瘤检测工作中，甲状腺蛋白以甲状腺球蛋白为主要表达形式，占蛋白总量的75%左右，可作为甲状腺激素生物合成的基础。并且，受到蛋白水解酶的影响，甲状腺激素可以脱离TG，之后释放至血液当中。在通常情况下，循环血中含有微量甲状腺球蛋白，甲状腺疾病患者、特别是甲状腺肿瘤患者，其血液甲状腺球蛋白浓度相对较高，甲状腺球蛋白的半衰期通常在4～60h之间。所以，应用化学发光免疫检测法时患者的甲状腺球蛋白个数以及甲状腺球蛋白水平明显高于放射免疫分析法检测，同时检测结果的灵敏度、特异性、准确率均较高，所以甲状腺肿瘤患者有必要定期检查甲状腺球蛋白个数以及甲状腺球蛋白水平，以及时根据其实际情况调整治疗方案[8]。

(3)多组分化学发光免疫分析方法

将多组分检测的方式应用于单个分析流程之中，能够呈现出所需时间段、分析通量高以及样品消耗少等优势，且相对其他模式来说，分析成本也相对更低。多组分化学发光免疫分析中主要包含两种不同的检测模式，一种是多组分同时检测模式，另一种是顺序检测模式，前者可与阵列检测器或是空间分辨技术进行结合，从而同时针对数个待测物开展检测工作，后者则可在移动固定的时间之内针对不同的组分进行逐一的检测。根据最近几年的情况来看，目前在多组分免疫分析中应用频率较高的多组分化学发光免疫分析方法为安培免疫传感器阵列，该方法同时将多通道电化学工作站和电极阵列作为基础，大幅度推动了多组分化学发光免疫分析方法的发展，如图2所示[9]。

图2 通道底物二维分辨化学发光多组分免疫分析方法

例如，在应用底物区带分辨化学发光多组分免疫传感系统的过程中，可以应用单个分析流程针对癌胚抗原（CEA）以及癌胚抗原125（CA125）两种肿瘤标志物进行检测，将二者的捕获抗体固定在经过醛基活化处理的UltraBind膜上，形成免疫反应器之后，将样品、ALP标记CEA抗体、HRP标记CA125抗体共同注入免疫体反应器开展在线温育工作，经过夹心免疫反应后，将ALP以及HRP的化学发光底物区带逐一通入，即可同时针对二者进行检测。

4.结束语

进行生化检验工作的过程中，可以满足疾病标记需求的抗原类型较少，所以应该积极优化生化检验方法的应用情况，也就需要注重完善以下几项重点：

（1）进一步提升检验结果的灵敏度及准确性，延长检验下限，提升分析结果放大倍数，以不断拓展化学发光免疫检测法的实用性及应用范围。

（2）优化化学发光免疫检测相关的仪器设备，促使其进一步实现小型化和智能化，以能够在整体上提升化学发光免疫检测法的灵敏度、特异性和准确性，从而在各类疾病的诊疗工作中发挥更加重要的作用。