液相色谱串联质谱法优化水产养殖底泥中磺胺类抗生素的提取

＊陈玉婷 李桂滢 宋成 伍仕权 龙思雨 朱良茂 杨孝容

（乐山师范学院新能源材料与化学学院 四川 614000）

抗生素在水产养殖中用于治疗和预防动物的疾病以及促进生长和提高饲料的利用率，使用非常广泛，但摄入体内的抗生素大部分以原药或初级代谢的方式排出体外进入环境，部分沉积在底泥，环境中抗生素残留以及耐药细菌的传播、扩散等引起环境污染[1-3]。通过水体和底泥抗生素含量监测，可以了解抗生素的使用和残留情况。底泥的成分复杂，有很强的吸附性，影响底泥抗生素监测准确度的主要因素是提取方法相关报道较多[4-6]。

本文以高效液相色谱-串联质谱为监测手段，以加标回收率为指标，单因素变量法优化底泥抗生素的提取方法，为准确测定底泥磺胺类抗生素提供技术支持。

1.实验部分

(1)主要仪器与试剂

LC-20A和LC-MS 8030三重四级杆液相色谱-质谱联用仪配电喷雾电离源（ESI），ATY124分析天平，HLB 200mg/6mL小柱，上述购置日本岛津；ST 16R冷冻离心机（赛默飞世尔）；固相萃取装置（美国Supelco公司）；DOA-P504-BN真空泵（GAST公司）；LGJ-12A冷冻干燥机（四环科仪）；KQ-300GDV超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；NK200-1B氮吹仪（无锡沃信仪器有限公司）；0.22μm滤膜。

磺胺标准品均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司：磺胺二甲异嘧啶（SMO）、磺胺醋酰（SA）、磺胺嘧啶（SD）、磺胺噻唑（ST）、磺胺吡啶（SP）、磺胺甲基嘧啶（SMZ1）、磺胺二甲基嘧啶（SMZ2）、磺胺甲噻二唑（STZ）、磺胺甲氧哒嗪（SMP）、磺胺对甲氧嘧啶钠盐（SME）、磺胺间甲氧嘧啶钠盐（SMM）、磺胺氯哒嗪（SCP）、磺胺邻二甲氧嘧啶（SDO）、磺胺甲噁唑（SMX）、磺胺二甲异噁唑（SDX）、磺胺间二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺喹噁啉（SQO）。

柠檬酸，磷酸氢二钠，乙二胺四乙酸二钠（EDTA），氢氧化钠，磷酸，上述试剂均为分析纯；甲酸和甲醇为色谱纯（r）。实验用水为怡宝饮用纯净水。

(2)溶液的配制

用甲醇配制200mg/L的单标储备液，储于4℃冰箱；临时用甲醇配制4.0mg/L的混标工作液；用定容液配制为5～500μg/L混标溶液。

0.1mol/L柠檬酸溶液；0.05mol/L EDTA-0.05 mol/L Na2HPO4溶液，用NaOH溶液或H3PO4溶液调节至所需pH。

(3)样品前处理

将采集的养鱼池塘底泥，冷冻干燥，研磨过60目的筛子并装于自封袋放干燥器备用。

条件优化：称取2g（称至0.0001g）4份样品于50mL离心管中，两份加入1.0μg/mL标液2.00mL，另外两份不加标样，每支离心管加入10.0mL提取液（缓冲溶液VmL+甲醇(10-V)mL），20℃超声10min，5000r/min 20℃离心10min，离心液转入试剂瓶，残渣再重复两次以上操作，合并3次离心液加水至150mL左右，用1.0 mol/L的磷酸和氢氧化钠调节pH；过HLB小柱净化富集（小柱用5mL甲醇和5mL水活化），抛弃流出液，再用5～10mL水淋洗小柱；减压抽15min，用8mL甲醇洗脱，收集洗脱液于15mL离心管中，40℃氮吹至干，用甲醇-0.5%甲酸水溶液（3:7）的定容液2.00mL溶解，过0.22μm滤膜装于色谱样品瓶，按“1.4”的色谱和质谱条件分析。

(4)色谱条件和质谱条件

色谱条件：用Shim-pack VP-ODS（150mm×2.0 mm，5μm）色谱柱；流速0.3mL/min；进样量5μL；柱温35℃；运行时间19min；流动相A 0.2%甲酸水溶液，B甲醇；梯度洗涤程序见表1。

表1 高效液相色谱梯度洗涤程序

质谱条件：离子化模式为电喷雾正离子模式；扫描模式为多反应监测；碰撞气为氩气；毛细管电压4.5kV；雾化气为氮气3L/min；干燥气为氮气15L/min；加热模块温度400℃；DL温度250℃。

2.结果与讨论

(1)色谱条件和质谱条件的优化结果

配制浓度为500μg/L的17种磺胺溶液的单标，选择Sacn（+）模式，Q3扫描寻找母离子，以母离子作为前体离子m/z，系统软件自动优化产物离子及MRM参数；然后接上色谱柱优化色谱条件，色谱条件见表1；17种抗生素的色谱保留时间和质谱参数见表2。

表2 17种磺胺的保留时间和质谱参数

(2)缓冲溶液的选择

缓冲溶液：0.1mol/L柠檬酸（含0.1g EDTA），pH6.5的Na2HPO4-EDTA和pH10.0的Na2HPO4-EDTA。缓冲溶液8.0mL+甲醇2.0mL提取，调节pH3.0过HLB小柱，其余与“1.3”相同，样品加标回收率见图1。

图1 不同pH缓冲液的样品加标回收率

从图1可知，缓冲溶液与甲醇按8:2提起磺胺类抗生素，柠檬酸缓冲液和pH10缓冲溶液的整体效果较pH6.5缓冲溶液的效果好。但二者的效果悬殊不大。实验选择缓冲液0.1mol/L柠檬酸（含0.1g EDTA）溶液进行后续实验。

(3)过HLB小组的pH选择

以0.1mol/L柠檬酸8.0mL与2.0mL甲醇（加0.1g EDTA），其余与“1.3”节相同，过HLB小柱前调节溶液的pH3.0和5.0，考察加标回收率，实验结果见图2。图2表明过柱溶液的pH对磺胺类抗生素的加标回收率的影响不明显。后续实验选择提取液调节pH3.0过小柱。

图2 pH3.0和pH5.0过柱的样品加标回收率

(4)提取液的选择

以0.1mol/L柠檬酸+甲醇（加0.1g EDTA）8.0mL+2.0mL、7.0mL+3.0mL、6.0mL+4.0mL和5.0mL+5.0mL，选择提取液，结果见图3。

图3 甲醇与柠檬酸溶液的比例对加标回收率的影响

图3表明，多数磺胺以0.1mol/L柠檬酸与甲醇8:2～5:5（加0.1g EDTA）作提取液的加标回收率差异不大，但SDX和SQO提取液中甲醇40%～50%较理想。后期实验选择0.1mol/L柠檬酸（含0.1g EDTA）6.0mL+4.0mL甲醇作提取液。

(5)不同加标浓度回收率的测定

在样品中分别加入0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.25μg/mL的混标2.00mL，提取液采用0.1mol/L的柠檬酸6.0mL+4.0mL甲醇，加入0.1g EDTA，其余与“1.3”完全相同，相当于加标浓度0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.25mg/kg，每种加标浓度平行4次。加标回收率结果见图4。

图4 三种浓度的加标回收率

图4可知，17种磺胺的三个水平的样品平均加标回收率在61%～97%，相对标准偏差RSD在1.1%～8.9%。除SA和SQO的加标回收率可能低于70%，其余15种磺胺的样品加标回收率在70%～97%。

本文优化的提取水产养殖底泥中磺胺类抗生素的方法，三个加标水平的回收率与文献[3-6]报道的回收率相当或约高，但本文的提取溶剂和洗脱剂更简单，有机溶剂的用量较少。

3.结论

本文固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法优化了水产养殖底泥中17种磺胺类抗生素的提取方法。采用0.1mol/L柠檬酸与甲醇6:4加0.1g EDTA提取3次，合并提取液稀释至150mL，调节pH3.0，用HLB固相萃取小柱富集净化，甲醇洗脱，氮吹浓缩，甲醇-0.5%甲酸水溶液3:7溶解定容，以0.2%甲酸水溶液-甲醇作流动相色谱梯度洗涤分离，串联质谱正离子模式多反应监测。提取剂简单、成本较低、底泥样品的加标回收率高，可用于水产养殖底泥磺胺类抗生素的测定。