基于BDNF-TrkB/proBDNF-p75NTR信号通路探讨电针治疗脊髓损伤的分子机制*

叶青,时素华,姚海江,胡煜,曹祖懋,李志刚

北京中医药大学,北京 100029

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是指由于交通安全事故、跌落伤、暴力损伤等直接或间接因素导致的[1],在损伤的相应节段出现的各种感觉、运动、括约肌功能等障碍,肌张力异常及病理反射等相应改变[2]。世界卫生组织2017年发布的报告显示,每年大约新增25～50万脊髓损伤患者,全世界大约有200～300万人患有脊髓损伤相关残疾[3]。脊髓损伤患者具有高致残率和高死亡率的特点,并且康复期间并发症发生率高[4-5]。刘俊等[6]对252例创伤性SCI患者的日均住院费用的影响因素进行研究,康复治疗总住院费用最高424万元,日均费用 287～4 473元。脊髓损伤给家庭和社会都造成了严重的经济负担[7],寻找更加有效、安全的治疗手段迫在眉睫。

脊髓损伤机制主要分为原发性损伤和继发性损伤[8]。其治疗策略主要包括增强神经保护,减少继发性损伤以及通过激活神经元再生能力、改善微环境等促进再生修复[9]。脊髓损伤后,神经营养因子(neurotrophic factors,NTFs)的缺乏是导致再生失败的主要原因之一。神经营养因子通常是通过轴浆运输以受体介导的方式进入神经末梢,以此来促进胞体有关蛋白质的合成,神经细胞的再生、发育和功能恢复[10]。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、神经营养素-3(neurotrophin-3,NT-3)、神经营养素-4/5(neurotrophin-4/5,NT-4/5)是经典的神经营养因子,研究相对成熟。目前,脑源性神经营养因子是实验性脊髓损伤中研究最多的神经营养因子。BDNF是1982年Barde等[11]从猪脑中分离出的一种神经元存活诱导因子。自被发现以来,其在神经系统中的功能及其在细胞和分子水平上的作用一直是深入研究的主题,且BDNF作为细胞存活和神经突起生长促进剂在治疗脊髓损伤中的潜力作用激发了人们的进一步探索的兴趣[12]。前期研究发现,电针治疗脊髓损伤可以显著提高BDNF、原肌球蛋白受体激酶B(tropomyosin-receptor kinase,TrkB)蛋白的表达,下调p75NTR蛋白的表达,相关理论探究如下。

1 脑源性神经营养因子的三种亚型

BDNF主要作用于红核脊髓束和红核神经元,在神经元和神经胶质细胞中合成[13]。BDNF的3种亚型分别是:BDNF成熟体(Mature Brain-derived Neurotrophic Factor,mBDNF)、BDNF前体(Brain-derived Neurotrophic Factor Precursor,proBDNF) 和 BDNF前肽 (Pro-peptide of Brain-derived Neurotrophic Factor,BDNF pro-peptide)。BDNF经历一个转录合成、剪切和降解代谢的过程。最开始,通过激活转录因子启动转录[14],这一过程包括神经细胞调节活动、钙离子通道等相关途径,N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-Aspartic Acid NMDA)受体和电压门控钙离子通道促进Ca2+内流启动转录。BDNF基因转录为mRNA,BDNF mRNA进入胞浆,在内质网中合成的pro-pro-BDNF,然后通过去除信号肽将其转化为pro-BDNF。proBDNF包含C端成熟结构域及N端前结构域,经细胞内蛋白酶和细胞外蛋白酶外切割N端前结构域,产生mBDNF。此时水解剩下的部分前结构域即为BDNF pro-peptide[15-17]。组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)激活组织纤溶酶原产生的纤溶酶,一些基质金属蛋白酶(matrix metalloproteases,MMPs)均可细胞外裂解proBDNF产生[18]。这种切割发生在哪里、所涉及的蛋白酶的性质仍然存在争议[19]。目前,关于BDNF前肽在脊髓损伤中的相关生物学作用研究较少。但值得注意的是,有研究发现,BDNF前肽直接促进海马长时程抑制,并且BDNF多态性Val66Met在66个氨基酸处将缬氨酸取代成甲硫氨酸,影响BDNF前肽的生物活性,BDNF pro-peptide对BDNF的生物作用施加额外的功能改变的可能性[20]。mBDNF和proBDNF在脊髓损伤后发挥着相对立的作用。

2 BDNF-TrkB/proBDNF-p75NTR在脊髓损伤中不同的生物学效应

在中枢神经系统中,BDNF与proBDNF分别作用于不同的受体,在脊髓损伤中发挥不同的生物学效应[9]和其他神经营养因子一样,BDNF通过结合相应受体来激活细胞内多种下游信号通路在脊髓损伤中发挥作用。每种神经营养蛋白都有其特异性的高亲和力原肌球蛋白受体激酶(tropomyosin receptor kinase,Trk)受体,也能与有较低亲和力p75NTR受体结合、发挥特定的神经保护等生物效应[21-22]。酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase receptor,TrkB)是BDNF的特异性受体,BDNF与TrkB特异性结合并具有高亲和力,结合相互作用主要发生在TrkB受体的免疫球蛋白样结构域(Ig1和Ig2)[23-24]。BDNF诱导的TrkB信号可能通过四种主要的细胞内途径影响突触可塑性、轴突生长、存活和细胞内阳离子平衡[25-27]。(1)经磷脂酰-3激酶(P1-3K)/Akt通路促进神经元树突分枝和树突棘生成,影响突触生长和结构形成;(2)受体诱导小分子GTP酶Ras的激活,经过一系列复杂的磷酸化过程,最终激活许多细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)途径并对环腺苷3′,5′-单磷酸(adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate,cAMP)含量进行调节,促进轴突生长;(3)经磷脂酶C-γ(phospholipase C-γ,PLC-γ)/肌醇3-磷酸(Inositol triphosphate,IP-3)通路参与Ca2+的调控,促进Ca2+从细胞内储存释放,促进突触可塑性等[28];(4)通过N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-D-aspartic acid,NMDA)受体的磷酸化,TrkB信号可能导致钙和钠内流的增加[29]。同样,TrkB-PLC途径的激活也可能导致钙依赖的通道开放,从而进一步提高细胞内钙浓度以及钠浓度,进而提高膜电位。BDNF最快的兴奋性效应已被证明与Nav1.9有关,导致钠内流迅速,其时间尺度上类似于谷氨酸的作用,其效力远远超过神经递质的效力[30]。除了BDNF的快速兴奋作用,TrkB具有对受体氯离子通道的抑制能力,可通过下调氯化钾共转运蛋白KCC2,可以将细胞表面KCC2的损失显著降低[31-32]。当然,这些途径不是完全分离的,并且在功能上可能重叠和互补[12]。

在没有TrkB的情况下,BDNF与p75NTR结合的成熟神经营养蛋白可以激活Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK),通过p53的激活触发细胞死亡[33-34]。有研究显示,在p75NTR介导的皮质少突胶质细胞死亡过程中,JNK激活以神经生长因子依赖的方式起作用[35]。在交感神经元中,p75NTR可以通过与BDNF结合,通过一种JNK非依赖性机制触发促凋亡级联反应[36]。proBDNF可能有着和BDNF相反的生物学功能,与p75NTR高亲和力结合,脊髓损伤后,proBDNF及其受体sortilin和p75NTR在脊髓中表达升高[37]。sortiLin受体结合proBDNF的N末端前结构域[38],形成proBDNF/p75NRT/sortilin复合物触发JNK相关通路、激活启动caspase依赖的细胞凋亡诱导神经元程序性死亡,破坏神经可塑性,诱发神经元凋亡,这种分子的上调可能发生在受伤状态[39]。同时,proBDNF还可以激活RhoA依赖性信号通路,Rho是控制肌动蛋白聚合的关键分子,充当神经元生长的开关,抑制轴突生长[12]。

综上,p75NTR在BDNF在脊髓损伤的发展中有其双面性,BDNF与TrkB的结合在许多方面受到p75NTR的影响。p75NTR可以通过影响受体来促进配体与Trk受体的结合,这可以增加TrkB的亲和力并减少其他蛋白的结合[40-42]。p75NTR还可以促进BDNF的内吞作用和向膜室的逆向转运,在膜室中他们可以与TrkB受体相互作用,并可以减少Trk泛素化,这可以延迟受体的内化和降解,从而允许更长的信号传递期[43-44]。此外,p75NTR可以激活Akt等促生存途径,与Trk介导的神经营养因子效应协同作用[45]。但总的来说,p75NTR受体的激活更多的是对抗细胞存活和生长的方式运行,触发几个潜在的促凋亡级联。p75NTR信号通路在细胞存活、细胞周期调节和突起外生长中起着重要作用。脊髓损伤后,p75NTR的表达增高,敲除p75NTR基因或阻断p75NTR信号通路均可以促进细胞的存活、延缓病情的发生。在大多数情况下,p75NTR作为配体刺激的凋亡受体发挥作用诱导JNK-p53-Bax凋亡途径:这一通路包括c-Jun的磷酸化、p53的激活、Bax线粒体易位、细胞色素C的释放以及Caspase-3,6,9的激活等。在p75NTR介导的信号通路中,神经酰胺作为脂质第二信使分子[46-47],神经酰胺的释放能激活抑制神经细胞生长、促进神经元凋亡的JNK通路[21]。此外,p75NTR还可以调节其他细胞死亡的蛋白质(如NRIF)的活性、NF-κB通路等[48]。因此,不同的生物学效应可能由成熟BDNF或proBDNF的相对丰度,以及TrkB和p75NTR受体可用性的相互作用决定[34,49]。

3 电针治疗脊髓损伤

脊髓损伤属于中医学“体堕”“痿痹”等范畴。电针治疗脊髓损伤时,一般选取督脉电针或者夹脊电针,可以起到加强督脉经气感应,促进气血运行,改善微环境的作用。针刺治疗脊髓损伤的机理以神经-体液为主要方向。其中,不可忽略的就是神经递质,其是由神经末梢释放,通过突触间隙传递到下一个神经元,再通过神经-效应器接点的间隙,作用于肌肉或腺体等效应细胞。电针治疗脊髓损伤一般采取疏密波的形式,以兴奋效应为主,具有促进代谢、调节气血运行、消除炎症水肿等作用。电针治疗脊髓损伤的机制有以下几种:(1)电针可以通过提高BDNF促进神经元的存活。近几十年来,BDNF在促进神经元存活方面的潜力得到了广泛的研究。脊髓损伤后,神经元中促凋亡因子通常会上调,TrkB信号可以通过磷脂酰-3激酶(P1-3K)/Akt通路抑制上调[50-51]。Hammond等[52]研究发现,BDNF可促进体内被轴突切除的成年大鼠皮质脊髓神经元的长期存活,该研究在轴突切开后第一周内通过脑室注入BDNF 14 d,随后28 d不进行治疗,发现BDNF能够促进CSN存活至少42 d。(2)电针可以通过提高BDNF促进受损纤维的再生。BDNF的神经营养作用不只是促进神经元的存活,还可以通过刺激GAP43和T-alpha-1-tubulin等再生相关基因的表达[53]、通过ERK增加第二信使cAMP的表达水平等途径使轴突克服髓鞘抑制[54],促进受损纤维的再生。Blits等[55]将腺相关病毒载体介导BDNF基因AAV-BDNF转染施万细胞后移至脊髓损伤处,注射后16周,通过观察接受编码绿色荧光蛋白或盐水的AAV载体,与对照组比较,注射AAV-BDNF的大鼠损伤部位轴突再生,后肢运动功能明显改善。(3)电针可以通过提高BDNF促进神经可塑性。BDNF可以帮助脊髓损伤后在不同生理水平上重新连接神经元网络,促进神经的可塑性。研究已经证明了轴突发芽和运动功能改善之间存在直接联系,因此增强这些自发的重组也是当前治疗脊髓损伤的有效策略[56]。有学者研究发现,BDNF可引导植入神经元干细胞轴突向假定的靶标生长,其将表达BDNF延髓的慢病毒载体注射到受伤区域会产生神经营养蛋白梯度,并促进轴突的定向生长达 9 mm,与注射GFP慢病毒的对照动物相比,注射BDNF慢病毒(2.5 mm和5.0 mm)的动物显示出明显更多的轴突和更长的轴突,并且5.0 mm-BDNF组显示出在延髓方向上延伸的偏好[57]。(4)电针可以通过提高BDNF促进髓鞘形成BDNF基因修饰的成纤维细胞,明显增加少突胶质细胞和施万细胞的增殖,通过上调MBP的表达,抑制少突胶质细胞的死亡来促进髓鞘的再生[58-59]。有学者观察BDNF对脊髓损伤后少突胶质细胞存活和功能恢复的影响,脊髓损伤大鼠24 h内MBP表达在损伤后大大降低,但BDNF给药2周后可促进MBP表达的恢复,而MBP上调的促进可能与持久的恢复作用有关[60]。(5)电针可以通过提高BDNF水平在炎症和继发性损害中发挥作用。继发性损伤是脊髓损伤后的重要病理过程,由许多过程组成,包括炎症和活性氧的产生和释放。Wong等[61]研究发现,ProBDNF和成熟的BDNF在体外从巨噬细胞释放。体内巨噬细胞(ED1+)和体外分离巨噬细胞(CD11b+)表达中等水平的proBDNF,sortilin和p75NTR。ProBDNF抑制了体外分离的巨噬细胞的迁移,而针对proBDNF的抗体则增强了迁移。对BDNF的前结构域施用抗血清来抑制proBDNF,可增加巨噬细胞的浸润并增加受伤的脊髓中神经元的数量。针对proBDNF的抗体治疗可改善脊髓损伤后的功能恢复。这表明,proBDNF是巨噬细胞迁移和浸润的抑制因子,说明内源性proBDNF可能抑制脊髓损伤后ED1+炎症细胞的浸润。

4 小结

综上所述,电针治疗脊髓损伤具有简、便、验、廉的优势,既可以与其他药物、康复疗法及手术治疗配合使用,也因为其无不良反应的特点,在脊髓损伤后,可作为长期治疗的手段。电针治疗脊髓损伤,可使BDNF与TrkB高亲和力结合,促进脊髓损伤的修复。ProBDNF与p75NTR高亲和力结合,介导细胞凋亡机制。电针治疗脊髓损伤的机制十分复杂,是当前急需解决的问题。在前期研究的基础上,笔者认为,电针可以通过激活BDNF-TrkB信号通路,抑制proBDNF-p75NTR信号通路来实现对神经的再生修复。本理论的提出将为电针治疗脊髓损伤再生修复机制提供新思路,为临床电针治疗脊髓损伤提供理论依据。