植物中角鲨烯环氧酶的研究进展

宓雅琪,高龙龙,2,宋泽,高海云,赵欢△（.首都医科大学中医药学院,北京 00069;2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京 009;.中国中医科学院中医药健康产业研究所,江西 德兴 4200）

1 引言

角鲨烯环氧酶（[EC1.14.99.1]squalene epoxidase，SQE）属于A类的黄素蛋白单加氧酶，广泛存在于动物、真菌、植物等真核生物中，可催化角鲨烯的碳-碳双键发生环氧化反应，生成2,3-环氧角鲨烯（2,3-oxidosqualene，OS）。SQE发挥催化功能一般需要黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）等辅因子的参与[1]，且依赖NADPH-细胞色素P450还原酶（NADPH-cytochrome P450 reducatse，CPR）[2]将环氧基团引入到角鲨烯的碳-碳双键中[3]，黄素被还原后NADP+立即释放（见图1）。SQE是甾醇和三萜生物合成中第一个引入氧的酶，是第一个需要外援电子输入的酶，也是途径中继3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR）之后第二个重要的限速酶。

诺贝尔奖获得者Corey E.J在1966年首次发现OS是角鲨烯到羊毛甾醇转化的必需中间体，推翻了此前“氧化和环化同步进行不经过中间体”的假说[4]。对催化这一氧化步骤的SQE最早的报道来自于哈佛大学的S Yamamoto[5]等研究者，早在1970年其将从兔肝脏中提取的微粒体与角鲨烯一起孵育，发现加热处理后环氧角鲨烯环化酶的活性丧失，然而角鲨烯转化为环氧角鲨烯的酶活力并没有减弱。日本的T Ono[6-7]等研究者证实角鲨烯环氧酶系统包括两个部分，即末端氧化酶SQE和黄素蛋白CPR，且首次从兔肝微粒体中纯化得到SQE并确定了其在体外的活性测定方法。第一个SQE基因（ERG1）则由A Jandrositz[8]等人通过构建酵母突变体库克隆得到，随后Landl[9]等人利用基因敲除技术获得的erg1缺失的酿酒酵母突变株成为了后续验证异源SQE基因功能的主要表达系统之一。Nagumo[10]等人通过去除兔源SQE的N末端99个氨基酸后在大肠杆菌（Escherichia coli）中首次得到有活性的重组蛋白，值得注意的是动物中SQE需要S105 fraction激活。1992年就有了关于从猪肝中纯化出来的SQE在pH7.4时能够将一半的OS转化为2,3;22,23-双环氧角鲨烯（2,3;22,23-dioxidosqualene，DOS）的报道[11]，多个物种体内也检测到了在氧化鲨烯环化酶（oxidosqualene cyclase，OSC）抑制剂下能够同时积累OS和DOS。虽然同属于单加氧酶系，但是与细胞色素P450单加氧酶不同的是，SQE依赖于FAD，无heme结构域，不受P450抑制剂的调控。直到2002年Suzuki H[12]等人首次从植物中克隆到2个SQE基因，并在erg1缺失的酵母突变株K1N1中验证功能。由于SQE在不同物种中具有序列和功能的保守性，植物中SQE基因多年来受关注度低，导致其研究起步较晚，截至目前，虽然文献报道了多个植物来源的SQE基因信息，但是明确功能的并不多（见表1），深入开展研究的更是少之又少。然而，SQE在抑制剂、拷贝数、表达量以及酶系统组成等诸多方面存在物种的差异，提示了SQE在植物甾醇和三萜等生物合成途径中的重要作用有待深入挖掘，引发科研人员对植物SQE的关注和深入思考。本文对植物SQE基因的分子克隆、功能验证、基因表达调控等方面进行综述，并提出未来研究的新思路，为其进一步的研究和开发利用提供依据。

表1 不同物种来源的SQE基因信息汇总表

2 SQE基因的克隆、鉴定与活性验证

2.1 植物中SQE基因克隆研究 基于酵母和哺乳动物SQE基因序列相似性，使得植物SQE基因变得相对容易。如1994年，拟南芥中的一段表达序列标签[13]被发现为ERG1同源序列，随后被命名为Sqp2；Ar.tha。1999年Schäfer[14]等人用Sqp2；Ar.tha为分子探针，在甘蓝型油菜中发现了两条SQE基因。此后，包括拟南芥及多种药用植物中的SQE基因[12,15-18]陆续得以克隆，为后续的功能验证等研究奠定了基础（见表1）。

2.2 SQE基因的功能验证研究 植物SQE基因功能研究始于蒺藜苜蓿，2个MtSQEs可以回补酵母K1N1中erg1的缺失，但N末端是否截断不影响其活性[12]。研究人员曾在大肠杆菌中表达不同植物SQE，多数表达为包涵体形式[22,27,29,39]，仅有绞股蓝来源的SQE纯化后可在体外复性[22]。Manzoor[21]等人成功在烟草中对甘草GgSQE1进行瞬时和稳定表达，验证其具有鲨烯环氧酶活性。Unland K[20]等人结合酵母回补实验、烟草中亚细胞定位以及橡胶草RNA干扰技术等手段较为系统地验证了橡胶草SQE的功能。

3 SQE基因的表达模式和蛋白定位研究

真菌和哺乳动物中SQE基因常为单拷贝，而植物中SQE基因往往有多个拷贝，且呈现不同的表达模式。例如，拟南芥[16]中AtSQE1和AtSQE3广泛表达，而AtSQE2和AtSQE4只最低丰度地表达，甚至在叶和种子中都未能检测到AtSQE2。人参[30]中PgSQE1几乎在所有器官中都丰富地分布，而PgSQE2只在叶柄和花蕾中较高表达。催眠睡茄[39]、白桦[24]、甘蓝型油菜[14,31,40]等物种的SQEs在叶子中表达水平最高，三七[17]、滇重楼[32]、雷公藤[27]、远志[33]等物种的SQEs在根中表达最高。黄芪[34]、泽泻[35]、罗汉果[29]、橡胶草[20]等植物中SQE均表现出明显的植物组织特异性。在植物生长发育的不同时期SQE基因亦表现出明显的差异表达。拟南芥SQE1基因[14]在种子发育早期缺失，但在中后期可以检测到；罗汉果中两个SQE基因都主要在果实中积累，但SgSQE1快速增长并在第15天达到最高水平，SgSQE2则在此期间内表达水平相对稳定。以上研究提示我们，植物中多拷贝的SQE基因参与不同的生物合成途径，很可能与特定的甾醇或三萜成分积累直接相关。

据报道，酵母SQE具有内质网和脂滴的双定位[41]。多种植物SQE的亚细胞定位显示位于内质网膜上[1]，研究人员分别在橡胶草TkSQE1的N端或C端与蓝色荧光蛋白Cerulean融合注射本氏烟草，观察到TkSQE1-Cerulean（C端）位于内质网膜上，而N端融合蛋白却未观察到荧光[20]，表明SQE与荧光蛋白在N端和C端融合方式可能影响蛋白的状态。此外，紫花苜蓿MsSQE1在洋葱表皮细胞中瞬时表达，由于试验方法的局限不能观察到细胞器的结构，仅在细胞膜上观察到微弱荧光[36]。

4 激发子对SQE基因表达的影响

植物免疫反应激发子（elicitor）是一类可以诱导植物发生免疫防御反应的化合物，按照来源可分为外源性激发子和内源性激发子[42]。大量研究表明，激发子可以诱导SQE基因及三萜和甾醇生物合成途径相关基因的表达，进而促进三萜和植物甾醇类活性产物的合成与积累（见表2）。

表2 影响植物SQE基因表达的激发子和转录因子汇总表

4.1 外源性激发子对SQE基因表达的影响 外源性激发子主要来源于对植物产生危害的微生物和昆虫等[43]，目前用于诱导三萜及植物甾醇类产物合成的主要为真菌类激发子。研究表明，黑曲霉菌（Aspergillus niger）可显著上调甘草[44]SQE基因的表达，与参与植物防御反应的一氧化氮、水杨酸、茉莉酸等信号分子有关。黑曲霉菌与热带念珠菌（Candida tropicalis）单独或混合使用[45]均可显著上调西洋参不定根中SQE基因的表达，促进人参皂苷的合成。丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi）可诱导西洋参[46]、滇重楼[47]中SQE基因的表达，促进人参皂苷和重楼皂苷的合成。几丁质脱乙酰化后的壳聚糖可诱导人参细胞的SQE基因表达[48]，通过激活MAPK通路增加人参皂苷的积累。此外，乙烯利、二环己基碳二亚胺和石决明可分别增强白桦[24]、人参悬浮培养细胞[49]和高丽参[50]中SQE基因表达。

4.2 内源性激发子对SQE基因表达的影响 内源性激发子来源于植物自身，目前用于诱导三萜和植物甾醇类活性产物合成的主要为茉莉酸酯类成分，如茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）和2-羟乙基-茉莉酸酯（2-hydroxyethyl jasmonate，HEJ）、二氢茉莉酸甲酯（methyl dihydrojasmonate，MDJ）等。

研究表明，一定剂量的MeJA可诱导植物SQE基因的表达，随之三萜和植物甾醇含量有所增加，如泽泻[35]、白桦[24]和人参[30]等。HEJ可诱导三七[17]SQE基因的表达，增加人参皂苷的合成，MDJ和JA共同作用[51]可诱导三七不定根中SQE等基因的表达，促进多种皂苷成分积累，并出现6种新产物。此外，脱落酸、赤霉素[21]亦被证明可上调甘草GgSQE1的表达。水杨酸可诱导栽培黑种草[19]SQE基因的表达。纤维素酶降解的人参悬浮细胞细胞壁[52]和低半乳糖醛酸通过不同作用机制上调人参悬浮培养细胞SQE基因表达[53-54]。

然而，内源性激发子并非对所有SQE基因的表达都具有促进作用。MeJA处理蒺藜苜蓿后MtSQE2基因的表达水平显著提高，而MtSQE1基因无明显变化[12]。MeJA能够上调雷公藤中TwSQE1-TwSQE4的表达水平[27]，却对TwSQE5无效。人参根受MeJA处理后PgSQE1水平上调，PgSQE2反而受到抑制。总之，内源性诱导子对SQE基因表达的影响包括促进、抑制以及无明显影响三种，暗示同一植物不同SQE基因拷贝参与了不同的生源途径，执行不同的生物学功能。

5 转录因子对SQE基因表达的影响

植物在长期进化过程中，形成了复杂的分子信号网络，从而能够迅速地感知外界环境并调控基因的表达，以适应、抵抗和耐受各种生物和非生物的胁迫。顺式作用元件一般位于基因的启动子中，使用染色体步移技术可得到SQE基因的启动子。如从催眠睡茄[39]、白桦[24]等植物中分别获得513bp、1193bp的SQE基因启动子序列，从中发现了多个与植物激素、生物和非生物胁迫相关的关键顺式作用元件。转录因子（transcription factor，TF）与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用，可调控基因的转录。目前发现植物中与SQE基因相关的转录因子多来自于bZIP、WRKY和MYB家族。

天门冬中的bZIP家族转录因子ArTGA1和ArTGA2与SQE基因启动子上的MeJA反应性顺式作用元件结合可调节其表达水平[37]。人参[55]中PgWRKY4X可与PgSE启动子W-box序列结合，其过表达可上调PgSE等基因的表达，进而增加人参皂苷的合成。催眠睡茄中WsWRKY1与SS和SQE基因的启动子W-box序列结合，促进甾体类物质醉茄素A的积累，可作为有效工具来增加甾醇和三萜合成、增强植物的防御反应[28]。桦树[56]中鉴定到2个转录因子，其中BpMYB21上调SQE基因的表达，BpMYB61则下调SQE基因的表达，表明BpMYB61可能为一种抑制性的转录因子。

6 SQEs酶的结构

植物中SQE基因一般编码500-600个氨基酸[29,57-58]，相对分子质量约为55-70kDa，等电点大约为7.5-9，多为疏水性蛋白，其二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主[57]。不同植物SQE的N末端同源性较低，如三七PnSE1和PnSE2的N末端70个氨基酸仅有20.7%的序列一致性[57]。从西葫芦[26]中鉴定出的3个CpSEs均具有鲨烯环氧酶活性，且其中CpSE2的活性最强，CpSE1和CpSE3活性稍弱。植物中SQE大多具有1个及以上跨膜域[29,57-58]，因此可能导致在原核系统中表达出没有活性的包涵体。近些年，人类SQE作为降胆固醇和癌症的潜在靶点越来越受重视，2019年Andrew J Brown[59]等人报告了期待已久的人类SQE结构，解析了其催化结构域的晶体结构及其与两种抑制剂的配合物，并对人类SQE催化生成DOS的机制进行阐释。首个SQE结构的解析一方面为与人类健康和疾病密切相关的SQE研究提供更具说服力的证据，另一方面为植物中SQE的挖掘提供借鉴。

7 总结

由于SQE基因在动物胆固醇、真菌甾醇合成途径中的重要作用，有关SQE基因的研究层出不穷，主要作为烯丙胺类新型降低胆固醇药物[60]、肿瘤治疗[61]、抗真菌药物[62]的靶点。一般而言，鲨烯环氧酶可催化角鲨烯环氧化生成OS，但目前在大鼠、猪、酵母、红芒柄花[25]、西葫芦、树莓中均曾检测到DOS的存在。然而，角鲨烯转化为双环氧角鲨烯的具体反应机理，双环氧角鲨烯在植物体内存在的生物意义及其下游产物在植物中发挥的功能均有待进一步的研究。一般而言，植物SQE通常优先使用OS，但有意思的是，叶敏团队发现与野生型相比，突变体AtLUP1T729F和SAD1S728F优先用DOS而不是OS。关键碱基改变引发底物顺序优先级的改变提示我们，基因突变或许也可以使角鲨烯在其他成键部位进行环氧化，这可能是一个值得深入研究的方向。

植物SQE酶不仅在催化功能、参与的生物合成途径等方面上存在差异，而且可与途径上其他酶甚至某一中间体发生相互作用影响催化效率。有关植物中SQE基因研究的根本目的是增加下游三萜或甾醇产物的产量。目前，研究的主要方向是通过上调植物或工程菌中SQE基因的表达水平来促进三萜或甾醇合成，少有关注提升SQE酶活性的研究，本文认为调节SQE酶活性、酶之间相互作用亦是有潜力的研究方向。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突