共同性外斜视猫的眼内直肌组织脑源性神经营养因子蛋白及mRNA表达观察

孙一帆，李晓彤，张伟，郝瑞

1 天津医科大学眼科临床学院，天津 300020；2 天津市眼科医院斜视与小儿眼科；3 天津市眼科学与视觉科学重点实验室；4 南开大学附属眼科医院眼科

共同性斜视（concomitant strabismus）是指眼球运动无障碍，斜视角度不随注视眼别和注视方向而改变的斜视。按偏斜的方向可将共同性斜视分为共同性内斜视和共同性外斜视［1］。共同性外斜视是临床常见的斜视类型，发病率1%～3%，可影响患者的双眼视功能发育，甚至破坏双眼视功能［2］。目前共同性斜视的治疗仍以手术为主，通过直肌手术来矫正患者眼位，但临床治疗效果不一［3］。共同性外斜视的确切病因和发病机制尚未完全阐明，可能与眼眶解剖结构、眼外肌的解剖异常、筋膜结构的异常、异常神经支配的集合和分开功能失衡等有关［4］。因此，了解眼外肌的病理变化，对于进一步认识共同性外斜视的发病机制以及指导临床治疗具有一定的意义。眼外肌是一种特殊类型的骨骼肌，具有组织重塑和持续自我更新的特点，能够持续表达肌球蛋白重链的未成熟亚型、神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）等。研究［5］发现，兔、猴等成熟哺乳动物未受损的眼外肌组织中肌卫星细胞含量较高。肌肉损伤时肌卫星细胞可被激活，增殖、分化后形成成熟的肌肉纤维。脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是体内含量最多的神经营养因子，通过与酪氨酸激酶B结合，维持和促进神经元的发育分化与生长再生［6］。BDNF 是视神经损伤后哺乳动物视网膜中一种有效的神经节细胞的神经保护剂［7］。CLOW 等［8］研究发现，BDNF 参与调节卫星细胞功能和肌肉损伤后的肌纤维再生。目前，关于BDNF 在共同性外斜视中作用机制相关研究较少。2022年6—8月，我们观察了共同性外斜视猫内直肌组织中BNDF 蛋白及mRNA 的表达变化，探讨BDNF 在共同性外斜视发病中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物培养、分组及共同性外斜视模型构建方法 3～4 周龄雌性猫28 只，体质量280～325 g。猫在12 h 光/暗周期、相对湿度（40%～70%）、温度（18～22℃）和噪音（＜50 分贝）的条件下自由获取食物和水。28只猫随机分为A、B、C 组及对照组，每组各7只。本实验经天津医科大学医学伦理学专业委员会批准，符合相关动物指南。A、B、C 组猫均佩戴双眼各15△底向外、尖向内三棱镜2、4、6 个月，构建共同性外斜视模型。对照组猫全天配戴平光镜片6个月。佩戴6 个月时，采用角膜映光法联合三棱镜检查，三组猫眼睛棱镜度＞10△，说明共同性外斜视模型造模成功，最终A 组6 只猫、B 组5 只猫、C 组5只猫造模成功。造模成功后取四组猫，经腹腔注射戊巴比妥钠（35 mg/kg，Sigma， CA， USA）麻醉后，用生理盐水冲洗双眼结膜囊，切开鼻侧结膜囊，钩取分离眼内直肌，留取眼内直肌组织。

1.2 各组猫眼内直肌纤维横截面积及肌卫星细胞数测算 采用Masson 染色法。 取各组猫眼内直肌组织，4%多聚甲醛溶液中固定48 h，脱水包埋，3～5 μm 的厚度连续切片，75%乙醇固定30 min，80%乙醇Ⅰ固定 30 min，80%乙醇Ⅱ固定 30 min，95%乙醇Ⅰ 固定150 min，95%乙醇Ⅱ固定 50 min，100%乙醇Ⅰ固定 60 min，100%乙醇Ⅱ固定 60 min，松节油Ⅰ固定 30 min，松节油Ⅱ固定 30 min，石蜡Ⅰ处理30 min，石蜡Ⅱ处理 30 min，石蜡Ⅲ处理30 min，组织切片用二甲苯15 min，无水乙醇处理5 min（2次），蒸馏水冲洗5 min（共2 次）。细胞核苏木精染色5 min，蒸馏水洗涤5 min（2 次），5 g/L 盐酸酒精诱导分化15 min。切片用丽春红品红溶液染色10 min，蒸馏水清洗5min（2 次），10 g/L 磷酸铝染色2 min。苯胺蓝或亮绿液处理5 min，再用0.2%冰醋酸水溶液浸泡。切片经95%酒精、无水酒精和二甲苯处理后用中性树胶封住，在BX51 光学显微镜（Olympus，Japan）下观察各组猫内直肌组织病理变化，测算内直肌纤维横截面积及肌卫星细胞数。重复测算3次，取平均值。

1.3 各组猫眼内直肌肌肉组织BDNF mRNA 检测 采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）法。取四组猫眼内直肌组织，收集内直肌总RNA，逆转录合成cDNA。反应体系为：荧光定量PCR 预混液10 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL，扩增条件为：98 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，变性-退火-延伸共循环40 次。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，Ct=实验组（Ct 靶基因-Ct GAPDH）-对照组（Ct 靶基因-Ct GAPDH），以2-ΔΔCt代表BDNF mRNA 的相对表达量。重复测算3次，取平均值。

1.4 各组猫眼内直肌肌肉组织BDNF 蛋白检测采用WESTERN Blotting 法。取四组猫眼内直肌组织，采集内直肌总蛋白。用BCA 蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime Biotech）定量总蛋白，在上样缓冲液中煮沸5～10 min。蛋白样品用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离2 h，转膜90 min。用5%脱脂牛奶与TBST溶液在室温下封闭1h 后，与1：1 000 稀释的一抗在4 ℃孵育过夜，然后在室温下加入含有1：2 000 稀释的辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase， HRP）标记的二抗孵育1 h，最后曝光X 光片，并使用Scion NIH 图像软件（Scion Corporation， MD， USA）进行条带分析。以目的蛋白条带灰度值/GAPDH 条带灰度值代表BDNF 蛋白的相对表达量。重复测算3 次，取平均值。

1.5 统计学方法 采用SPSS 21.0 统计软件（SPSS Inc.，IL，USA）进行数据处理。所得数据进行正态检验和方差齐性检验，正态分布的计量资料以-x ± s表示，组间两两比较采用非配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组猫眼内直肌纤维横截面积及肌卫星细胞数比较 对照组和各实验组猫的眼内直肌肌纤维形态正常，排列整齐，无细胞肿胀和变性，各实验组和对照组的内直肌肌纤维走向无明显差异（见图1）。A、B、C 组及对照组猫的眼内直肌肌纤维横截面积分别为904.33 ± 40.08、797.33 ± 33.13、702.33 ±46.65、1 005.33 ± 40.81，肌卫星细胞数分别为34.00 ± 3.46、20.00 ± 4，7.67 ± 2.08、3.33 ± 4.16，与对照组比较，A、B、C 组猫的眼内直肌肌纤维横截面积小、肌卫星细胞数少（P均＜0.05）。

图1 各组猫的眼内直肌肌纤维形态

2.2 各组猫的眼内直肌BDNF mRNA 相对表达量比较 A、B、C 组及对照组猫的眼内直肌BDNF mRNA 相对表达量分别为0.51 ± 0.05、0.41 ± 0.04、0.10 ± 0.04、1.00 ± 0.10，与对照组比较，A、B、C 组猫的眼内直肌BDNF mRNA 相对表达量低（P均＜0.05）。

2.3 各组猫的眼内直肌BDNF 蛋白相对表达量比较 A、B、C组及对照组猫的眼内直肌BDNF 蛋白相对表达量分别为0.85 ± 0.11、0.66 ± 0.05、0.14 ±0.05、0.97 ± 0.09，与对照组比较，A、B、C 组猫的眼内直肌BDNF 蛋白相对表达量低（P均＜0.05）。

3 讨论

目前，关于共同性外斜视的发病机制有解剖学、调节学、神经学和遗传学等几种理论，但仍未阐明［7］。近年来，一些研究［9］发现细胞因子与骨骼肌的损伤和修复有关，且在眼外肌中进行了研究，证实了细胞因子在眼外肌中的高表达；然而，目前仍不确定这些细胞因子是否参与了斜视的发生和发展，以及如何调节眼外肌的损伤和修复。因此，建立稳定、重复性好的共同性外斜视动物模型，研究相关细胞因子与斜视发生发展的相关性，不仅有助于深入了解共同性外斜视的发病机制，而且为探索斜视的非手术治疗方法提供了新的思路。

骨骼肌不仅是负责机体运动功能的主要器官之一，同时也是人体最大的代谢和内分泌器官，能合成、分泌、表达多种细胞因子和多肽，这些活性物质被称为肌源性因子（myokines），调节肌源性分化和肌肉再生，在骨骼肌的生长发育、新陈代谢以及一些疾病的病理过程中扮演了重要角色［10］。细胞因子属于不同的细胞间信号转导蛋白家族，在眼外肌细胞的增殖、分化和代谢过程中起着重要的调节作用。越来越多的研究发现，机械损伤、缺血和缺氧等病理刺激可以影响和改变细胞因子的活性［11］。胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）和心肌营养素1（cardiotrophin 1，CT-1）可以增加幼鸡成长期间眼外肌的力量和质量［12］。ANDERSON 等［13］表明，肌源性生长因子可以减少眼外肌的力量，这揭示了一种治疗斜视的潜在生物学方法。LI 等［14］研究发现，外源性IGF-1 治疗可促进猫斜视模型内直肌肌分化因子5（myocyte differentiation factor 5 ，Myf5）的表达，抑制转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）的表达。BDNF 是神经营养因子分泌蛋白家族中的一员，主要在大脑中产生，骨骼肌中也有合成，在神经肌肉功能中起重要作用。是视神经损伤后哺乳动物视网膜中一种有效的神经节细胞的神经保护剂［7］。

肌卫星细胞能够在肌肉损伤时被激活，分裂并修复受损的纤维或形成新的肌纤维［9］。许多成熟哺乳动物未受损的眼外肌含有活跃的肌卫星细胞［8，11］，这表明眼外肌具有自我更新能力。研究［8］发现，肌肉来源的BDNF 在调节肌卫星细胞增殖分化以及肌肉损伤后的再生方面具有重要作用。WILLOUGHBY 等［15］对猴应用外源性BDNF 后发现慢肌纤维先受影响，与对照组外直肌神经肌肉接头相比，慢肌纤维上的神经肌肉接头更大，对于快肌纤维的神经肌肉接头的大小或形态没有影响。而慢肌纤维能够维持眼外肌的张力，促进缓慢，持续的眼球运动。我们前期研究中将拟行外直肌后徙联合内直肌缩短术共同性外斜视患者分为术前斜视度数40△～60△、60△～80△、80△～100△组，采用RT-qPCR 法检测内直肌组织BDNF mRNA，结果发现，共同性外斜视患者内直肌BDNF mRNA 相对表达量随斜视度数增加而减少。本研究结果中，共同性外斜视的猫模型发现，与对照组相比，实验组的肌纤维横截面积和肌卫星细胞的数量明显减少。肌肉的横截面积是决定肌肉力量大小的重要指标，横截面积越大，肌肉收缩时产生的力量也就越大。实验组猫内直肌形态发生明显变化，力量减弱，引起斜视。这些数据不仅证明了猫的眼外肌与其他哺乳动物相似，具有活跃的肌卫星细胞，能够自我更新和重塑，还证实了共同性外斜视所导致的一系列病理变化如肌纤维横截面积减小、卫星细胞数量减少等与肌源性因子有关。此外，通过在动物模型中进一步研究发现，实验组BDNF的mRNA 和蛋白表达均明显降低，并呈下降趋势。明确了共同性外斜视中内直肌BDNF 的表达与斜视度数、病程具有一定的相关性，推测其可能通过调节肌肉力量参与调控共同性外斜视的发生发展。有研究［8］表明，BDNF能够调节肌肉卫星细胞的增殖和分化，以应对肌肉损伤后的修复。因此我们推测，在共同性外斜视发生时，内直肌的增殖、分化和代谢减少。BDNF 分泌减少，导致肌卫星细胞的增殖和分化能力也降低，阻碍了内直肌的生长、发育、修复和再生，最终使内直肌结构改变，力量减弱，眼位发生偏斜。此外，随着共同性外斜视病程的延长，BDNF的表达呈明显下降趋势，推测BDNF 的表达下降可能促进了斜视病情的进一步加重，提示BDNF 可能与斜视的发生发展有一定的相关性。

综上所述，共同性外斜视猫内直肌BDNF mRNA和蛋白表达降低，且随病程延长降低更明显。BDNF mRNA 和蛋白可能通过抑制猫内直肌肌肉卫星细胞数，参与共同性外斜视的发生发展。由于本研究只对截取的猫内直肌进行研究，共同性外斜视猫的外直肌及其他眼外肌组织中病理性改变及是其他调控因子尚需后续进一步研究。