RNA-linc00858和miR-3182在宫颈癌组织表达变化、对宫颈癌细胞株侵袭迁移调控作用及靶向关系

吴颖，魏敏，冀瑞晴，王建，罗彩霞，单燕丽

1 徐州医科大学研究生院，江苏徐州 221004；2 徐州医科大学附属医院妇科；3 新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州友谊医院妇产科

宫颈癌（CC）的发病率和病死率居女性生殖恶性肿瘤的首位。宫颈癌的发病率逐年上升，呈年轻化趋势［1］。目前，宫颈癌的主要治疗方法有肿瘤切除术、放疗和化疗，对于中晚期宫颈癌患者中放疗不耐受、不敏感以及宫颈癌复发患者的疗效不佳［2-3］。寻找新的、更有效的宫颈癌治疗方法是目前的研究热点。长链非编码RNA（LncRNA）是一类长度超过200 个核苷酸的转录本［4］。研究［5］发现，LnCRNAlinc00858 在肺癌、结直肠癌、骨肉瘤等恶性肿瘤的发生发展及转移中发挥重要作用。微小RNA-3182（miR-3182）是一种miRNA，可抑制肿瘤的发生发展［6］。但linc00858 与miR-3182 在宫颈癌组织中的表达变化及其在宫颈癌细胞的侵袭和转移过程中的相关研究较少。为此，2022 年1 月—2023 年1 月，我们观察了linc00858 和miR-3182 在宫颈癌组织表达变化、对宫颈癌细胞株侵袭迁移的调控作用，分析宫颈癌细胞中linc00858、miR-3182 的靶向关系。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 宫颈癌及癌旁组织linc00858、miR-3182 检测 选取徐州医科大学附属医院2022 年1—6 月间收治的宫颈癌患者40 例，均接受宫颈癌根治术治疗，术中保留宫颈癌及其相应癌旁组织（癌组织2cm 外组织）标本。纳入标准：①经病理学诊断为宫颈癌；②年龄45～60 岁；③临床分期ⅠB1～ⅡA1期；④入院前未经过放疗、化疗等治疗；⑤患者临床资料完整。排除标准：①合并其他肿瘤；②并非原发灶，由其他肿瘤转移所致；③存在严重的肝肾功能损伤、心肺疾病史，不能耐受手术。该研究方案已获得徐州医科大学附属医院伦理委员会的批准（XYFY2022-KL193-01）。宫颈癌及癌旁组织标本均在患者知情同意情况下获取。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测宫颈癌及癌旁组织linc00858、miR-3182 的表达。TRIzol 法提取宫颈癌及癌旁组织总RNA，逆转录成cDNA。PCR 扩增：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，70 ℃退火延伸30 s，共40 个循环。以18S 及U6 为内参，以2-ΔΔCt代表linc00858、miR-3182 相对表达量。linc00858 上游引物：5’- CCCAGCTCCTTACACACGTT-3’，下游引物：5’-TTCAGAGGCCTGCATCACTG-3’；miR-3182 上游引物：5’-CACTCAGCTGGCTTCTGTAGTG-3’，下游引物：5’- CTGGTGTCGTGGAGTCG-3’。重复检测3次，取平均值。

1.2 linc00858、miR-3182 对人宫颈癌细胞株迁移侵袭的调控作用观察

1.2.1 受试细胞筛选 人宫颈癌细胞株CaSki、Si-Ha、ME180、MS751 及人正常宫颈上皮细胞株Ect1/E6E7（ATCC 细胞库），接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基，5% CO2培养箱37 ℃培养。取对数生长期CaSki、SiHa、ME180、MS751 及Ect1/E6E7细胞，采用RT-qPCR 法检测linc00858、miR-3182 的表达，所有操作均同“1.1”。CaSki、SiHa、ME180、MS751 及Ect1/E6E7 细胞linc00858 相对表达量分别为3.11 ± 0.45、4.45 ± 0.44、6.22 ± 0.67、6.67 ± 0.78、1.00 ± 0.00，miR-3182 相对表达量分别为0.58 ± 0.08、0.60 ± 0.07、0.48 ± 0.04、0.69 ±0.07、1.00 ± 0.00。与Ect1/E6E7 细胞比较，4 种宫颈癌细胞linc00858相对表达量高，miR-3182相对表达量低（P均＜0.01）。选择linc00858 表达量最高的MS751进行后续研究。

1.2.2 MS751 细 胞 分 组 及 si-linc00858 、OE-linc00858 转染方法 培养48 h 时取对数生长期MS751 细胞，分为4 个组（1、2、3、4 组），每组6 个复孔。 1～4 组分别转染si-linc00858（小干扰linc00858，沉默linc00858 表达）、OE-linc00858（过表达linc00858）、si-NC（小干扰阴性对照）、OE-NC（过表达阴性对照），所有操作均严格按照Lipofectamine 2000 转染试剂说明书进行，培养8h后更换完全培养基继续培养。

1.2.3 各组细胞侵袭、迁移情况观察 转染48 h时取各组细胞，采用Transwell 实验观察各组细胞侵袭、迁移情况。所有操作严格按照使用说明书进行，于倒置显微镜下随机取3 个视野拍照（×200），计算各组侵袭细胞数、迁移细胞数。实验重复检测3次，取平均值。

1.2.4 各组细胞linc00858、miR-3182 检测 培养48 h 时取转染后各组细胞，采用RT-qPCR 法检测各组细胞linc00858、miR-3182 的表达。所有操作同“1.1”。重复测算3次，取平均值。

1.3 MS751细胞中linc00858与miR-3182的靶向关系分析 分别采用RNA 免疫沉淀测定（RIP）实验、双荧光素酶报告实验分析MS751 细胞中linc00858与miR-3182 的靶向关系。①RIP 实验：取对数生长期MS751 细胞分为两组，根据Magna RIPTM RNA 结合蛋白免疫沉淀试剂盒的说明，分别加入抗AGO2抗体和IgG 抗体（阴性对照），在RIP 缓冲液中加入linc00858与miR-3182抗体结合磁珠，处理细胞裂解物，提取沉淀RNA，采用RT-qPCR 方法检测linc00858 与miR-3182。重复检测3 次，取平均值。沉淀RNA 相对表达量具有统计学差异说明linc00858 与miR-3182 间存在靶向关系。②双荧光素酶报告实验：构建含有结合位点的野生型载体WT-linc00858 与含有突变位点的突变型载体MUTlinc00858。将MS751 细胞分为一、二、三、四组，分别转染WT-linc00858 + NC-miR、WT-linc00858+miR-3182 mimics （miR-3182 模 拟 物 ） 、MUT-linc00858+NC-miR 、MUT-linc00858 + miR-3182 mimics，转染24 h时检测各组相对荧光素酶活性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0 统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以±s描述，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，采用Spearman 相关性分析分析宫颈癌组织中linc00858 和miR-3182 的相关性。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌及癌旁组织linc00858、miR-3182 相对表达量比较 宫颈癌、癌旁组织linc00858 相对表达量分别为2.73 ± 0.22、1.00 ± 0.00，二者比较，P＜0.05。宫颈癌、癌旁组织miR-3182 相对表达量分别为1.00 ± 0.00、0.71 ± 0.04，二者比较，P＜0.05。相关性分析结果显示，宫颈癌组织中linc00858和miR-3182的表达呈负相关（r=0.343 2，P＜0.05）。

2.2 培养48 h 时各组细胞linc00858、miR-3182 相对表达量比较 培养48 h 时1、2、3、4 组细胞linc00858 相对表达量分别为0.45 ± 0.05、4.31 ±0.56、1.00 ± 0.00、1.00 ± 0.00，与3 组比较，1 组细胞linc00858 相对表达量低，与4 组比较，2 组细胞linc00858 相对表达量高（P均＜0.05）。培养48 h 时1、2、3、4 组细胞miR-3182相对表达量分别为4.36 ±0.60、0.54 ± 0.03、1.00 ± 0.00、1.00 ± 0.00，与3组比较，1 组细胞miR-3182 相对表达量高，与4 组比较，2组细胞miR-3182相对表达量低（P均＜0.05）。

2.3 MS751 细胞linc00858 与miR-3182 的靶向关系 ①RIP法分析结果为，加入抗AGO2抗体、IgG抗体的MS751细胞 linc00858和miR-3182沉淀RNA 相对表达量分别为0.68 ± 0.08、0.05 ± 0.02，二者比较，P＜0.05。 说明MS751 细胞中linc00858与miR-3182 存在靶向关系。②双荧光素酶报告实验结果为，一、二、三、四组细胞荧光素酶活性分别为1.00 ± 0.00、0.48 ± 0.04、1.00 ± 0.00、0.96 ±0.11。与一组比较，二组细胞荧光素酶活性低（P＜0.05），说明MS751 细胞中linc00858 与miR-3182 存在靶向关系。

2.4 培养48 h时各组细胞侵袭细胞数、迁移细胞数比较 培养48 h时1、2、3、4 组MS751 细胞迁移数分别为0.49 ± 0.05、3.71 ± 0.13、1.00 ± 0.00、1.00 ±0.00，与3 组比较，1 组细胞迁移数少，与4 组比较，2组细胞迁移数多（P均＜0.05）。培养48 h时1、2、3、4组MS751 侵袭细胞数分别为0.46 ± 0.06、2.84 ±0.21、1.00 ± 0.00、1.00 ± 0.00，与3 组比较，1 组细胞侵袭数少，与4 组比较，2 组细胞侵袭数多（P均＜0.05）。回复实验显示，培养48 h 时si-NC 组、si-linc00858 组、si-linc00858 + miR-3182 inhibitor 组MS751 细胞的迁移数分别为1.00 ± 0.00、0.55 ±0.08、0.91 ± 0.15，与si-NC 组比较，si-linc00858 组细胞迁移数少，与si-linc00858 组比较，si-linc00858+ miR-3182 inhibitor 组细胞迁移数多（P均＜0.05）。培养48 h 时si-NC 组、si-linc00858 组、si-linc00858+ miR-3182 inhibitor 组MS751 细胞的侵袭数分别1.00 ± 0.00、0.55 ± 0.09、0.87 ± 0.01，与si-NC 组比较，si-linc00858 组细胞侵袭数少，与si-linc00858组比较，si-linc00858 + miR-3182 inhibitor 组细胞侵袭数多（P均＜0.05）。

3 讨论

宫颈癌是发病率仅次于乳腺癌的女性第二常见恶性肿瘤。据报道，宫颈癌患者因肿瘤生长快、淋巴结转移率高等特点，预后较差［7］。进一步探究宫颈癌的发病机制以及寻求新的分子标记物对宫颈癌的诊断、治疗和改善预后有着重要的意义。近年来，lncRNA 作为多种疾病分子基础的一部分被广泛研究，是肿瘤领域的研究热点。据报道，lncRNA 与癌症的发生密切相关，它可以调节DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑，并作为miRNA 的前体，最终诱导癌症的发生［8］。与此同时，lncRNA 也可以与ceRNA 等与癌症发生发展密切相关的驱动基因竞争miRNA 反应元件，从而削弱miRNA 对靶基因的抑制，间接调节靶基因的表达水平，最终参与癌症的调控过程［9］。LncRNA 在宫颈癌中异常表达，并通过不同的分子机制来参与调控宫颈癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等过程［10］，有望成为治疗宫颈癌的有效靶点和预测预后的重要分子生物标志物。

Linc00858 （位于10q23.1 上，长度为2 685 nt）是一种新型的lncRNA，已被认为是致癌基因，它通过调节复杂的ceRNA 网络促进肿瘤发生发展。最先在肺癌中被研究，其在肺癌组织及细胞中异常高表达，且linc00858 的上调促进了肺癌细胞的增殖、侵袭和EMT［11］。我们前期研究中，linc00858 在宫颈癌细胞中表达水平显著上调，并通过miR-3064-5p/VMA21 轴促进宫颈癌细胞增殖，抑制细胞凋亡［12］，提示linc00858 与宫颈癌等肿瘤的恶性行为相关。因此为了深入研究linc00858 在宫颈癌发生发展中的作用，本研究首先检测了linc00858 在宫颈癌组织及细胞中的表达情况，结果发现在宫颈癌组织中linc00858 的表达明显高于癌旁组织，MS751 细胞中linc00858 的表达高于Ect1/E6E7 细胞，与之前的研究结果相一致。干扰linc00858 显著抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力，提示linc00858 可能成为治疗宫颈癌的潜在靶点，这与linc00858 在肺癌［11］、胃癌［13］以及结直肠癌［14］等恶性肿瘤中的作用相吻合。多项研究表明linc00858 的异常高表达与肿瘤不良预后相关，Ai 等［15］发现，linc00858 的高表达与胃癌的TNM 分期和淋巴转移有关，linc00858高表达患者的总生存期和无病生存期明显低于低表达患者。然而linc00858 的表达与患者的年龄、肿瘤直径、FIGO分期、TNM、淋巴结转移以及能否成为预测宫颈癌预后的生物标志物有待我们通过临床试验的进一步分析。

MiRNA 是一种具有17～25 个核苷酸的小型非编码RNA，已被确定为细胞过程的主要调节剂，它们在肿瘤的发生、进展和转移中起着至关重要的作用［16］。MiR-3182 是miRNA 家族之一，有人提出miR-3182 可作为部分肿瘤的抑制因子。在黑色素瘤的研究中，miR-3182 作为抑癌因子阻碍了黑色素瘤恶性行为的发展［17］。本研究首先通过RT-qPCR 检测发现miR-3182 在宫颈癌组织和细胞中的表达水平较低。通过双荧光素酶报告实验及RIP 实验验证linc00858 与miR-3182 之间存在靶向结合位点。上调miR-3182 的表达逆转了linc00858 对宫颈癌细胞恶性行为的促进作用，证实linc00858 可作为宫颈癌的促癌基因靶向负调控miR-3182 的表达。且回复实验表明，抑制miR-3182 的表达，可以抵消沉默linc00858 的表达对宫颈癌细胞侵袭和迁移的抑制作用。

综上所述，在宫颈癌组织及人宫颈癌细胞株中linc00858 高表达，miR-3182 低表达。Linc00858 可能通过竞争性结合miR-3182，抑制miR-3182 表达，促进宫颈癌细胞的侵袭和迁移。LncRNA 作用网络是一个多层次、多方向、多交互和多维的结构，linc00858 是否与其他miRNA/lncRNA/mRNA/RBPs通信形成RNA调控网络尚有待后续研究。